載BMP2質(zhì)粒DNA的殼聚糖溫敏水凝膠對牙周膜成纖維細(xì)胞相容性的評價.pdf

1、目的：本項目擬制備物理交聯(lián)殼聚糖-甘油磷酸溫敏水凝膠（CS/α,β-GP）負(fù)載含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白2質(zhì)粒DNA的殼聚糖納米粒CSn(pDNA-BMP2)，將其與CS/α,β-GP溫敏水凝膠復(fù)合，構(gòu)建CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合修復(fù)體系。研究該體系對人牙周成纖維細(xì)胞（HPDLCs）的細(xì)胞相容性。
　　方法：一、載BMP2質(zhì)粒DNA的殼聚糖納米粒(CSn(pDNA-BMP2))的制備及性質(zhì)檢測：成功構(gòu)建pDNA-BMP2

2、質(zhì)粒表達(dá)載體；采用離子交聯(lián)法制備載BMP2質(zhì)粒DNA殼聚糖納米粒CSn（pDNA-BMP2）；采用掃描電鏡觀察形態(tài)；zeta電位儀測定粒徑、分散度、Zeta電位；應(yīng)用瓊脂凝膠阻滯法分析CSn載體與pDNA-BMP2的結(jié)合能力及電荷性質(zhì)；運用酶保護法測定CSn載體對pDNA-BMP2的保護作用。二、CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP體系的構(gòu)建及性質(zhì)檢測：（1） CS/α,β-GP溫敏水凝膠的制備：采用物理交聯(lián)的方法制備CS/α,β-

3、GP溫敏水凝膠；掃描電鏡下觀察其微觀形態(tài)；試管倒置法測定其溫敏性。（2）CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP體系的構(gòu)建：取適量的CSn（pDNA-BMP2）磁力攪拌下分散于CS/α,β-GP溫敏水凝膠溶液中，構(gòu)建載CSn（pDNA-BMP2）的CS/α,β-GP溫敏水凝膠體系，即CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合體系；掃描電鏡下觀察其微觀形態(tài)；試管倒置法測定其溫敏性。三、CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP對HPDLC

4、s細(xì)胞相容性的評價：（1）原代培養(yǎng)HPDLCs，并鑒定組織來源。（2）HPDLCs在CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合體系中三維培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)及增殖情況。（3）將HPDLCs在CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合體系浸提液中培養(yǎng)，CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況；采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理所得數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果：一、CSn(pDNA-BMP2)的制備及性質(zhì)檢測結(jié)果：（1）空白CSn及CSn(pDNA-BMP2)

5、電鏡下觀察，呈球形，粒徑均一；CSn(pDNA-BMP2)粒徑較空白CSn略大。（2）CSn的平均粒徑為170nm，PDI為0.249，Zeta電位為45.5mv。CSn(pDNA-BMP2)平均粒徑為270.1nm，PDI為0.486，Zeta電位為27.0mv。（3）瓊脂凝膠電泳分析顯示，由于中和了質(zhì)粒DNA所帶的負(fù)電荷，電泳時質(zhì)粒不出孔，而裸質(zhì)粒pDNA-BMP2出孔，證明CSn能有效地結(jié)合pDNA-BMP2；（4）酶保護實驗顯示

6、，裸質(zhì)粒pDNA-BMP2及N/P為0.5：1的孔內(nèi)顯示空白無條帶，而CSn(pDNA-BMP2)在N/P為1：1、1.5：1、2：1、2.5：1時，則仍為白色。證明CSn(pDNA-BMP2)在N/P為1：1、1.5：1、2：1、2.5：1時，可以有效保護pDNA-BMP2免受酶的降解。二、CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合體系的構(gòu)建及性質(zhì)檢測結(jié)果：（1）試管倒置法顯示CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合體系均可在3

7、7℃下3 min內(nèi)由可流動的溶膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢闪鲃拥哪z狀態(tài)；（2）掃描電鏡顯示，復(fù)合體系為多孔的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且CSn（pDNA-BMP2）能均勻分散于水凝膠支架的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。三、CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP對HPDLCs細(xì)胞相容性的評價結(jié)果：（1）成功原代培養(yǎng)HPDLCs，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，培養(yǎng)的細(xì)胞HPDLCs波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性，證明細(xì)胞來源于外胚層。（2）結(jié)晶紫染色顯示，HPDLCs在CS/CS

8、n（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合體系中形態(tài)良好，48h后開始擴增。（3）CCK8實驗結(jié)果顯示，不同濃度的CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP溫敏水凝膠復(fù)合體系浸提液在1d和3d時均能促進HPDLCs的增殖，且CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP溫敏水凝膠復(fù)合體系浸提液培養(yǎng)的HPDLCs較CS-α,β-GP溫敏水凝膠浸提液培養(yǎng)的的細(xì)胞增殖更快。
　　結(jié)論：（1）CSn具有良好的形態(tài)、粒徑及電位。
　?。?）CSn能有