復(fù)方“前愈”治療慢性非細(xì)菌性前列腺炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：
　　中藥復(fù)方以中醫(yī)理論為基礎(chǔ)，運用“君臣佐使”原則多味藥物以合適劑量配伍而成，發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)復(fù)雜多樣，嚴(yán)重阻礙了中藥現(xiàn)代化進(jìn)程。復(fù)方“前愈”是武漢市第三醫(yī)院治療慢性非細(xì)菌性前列腺炎（chronic non-bacterial prostatitis，CNP）的經(jīng)驗方，前期藥效學(xué)研究、拆方實驗及長期臨床觀察等從不同角度證實其可發(fā)揮顯著治療效果，本研究結(jié)合前期實驗，查閱方中各藥材功能主治，化學(xué)成分，動物模型制備及藥理活性研

2、究等相關(guān)文獻(xiàn)資料后，以臨床患者服用的傳統(tǒng)劑型為基礎(chǔ)，從復(fù)方“前愈”水煎液中純化總黃酮、總多糖、總皂苷等化學(xué)部位，進(jìn)而通過慢性非細(xì)菌性前列腺炎藥理模型，篩選出活性成分，以期闡明“前愈”治療慢性非細(xì)菌性前列腺炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為后期開發(fā)有效部位新藥及新劑型提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　方法：
　　本文沿用中藥湯劑傳統(tǒng)臨床給藥形式，對復(fù)方“前愈”方進(jìn)行提取，選取總多糖、總黃酮及總皂苷三個化學(xué)部位，運用現(xiàn)代色譜理論，化學(xué)分析，儀器分

3、析方法進(jìn)行純化及含量測定，使其達(dá)到新藥申報中中藥有效部位可測量物質(zhì)含量占總提取出物質(zhì)50％的要求，結(jié)合藥理學(xué)研究模式，制備慢性非細(xì)菌性前列腺炎大鼠動物模型，通過測定前列腺指數(shù)，HE染色觀察病理組織改變，同時檢測大鼠慢性非細(xì)菌性前列腺炎相關(guān)細(xì)胞因子，考察不同化學(xué)部位及其組合對于治療慢性非細(xì)菌性前列腺炎的藥效活性，從中篩選有效化學(xué)部位及其組合，闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　純化總多糖和總皂苷工藝流程中，對復(fù)方“前愈”方兩次煎煮合并藥液，用無

4、水乙醇醇沉粗多糖，濾液備用，將粗多糖復(fù)溶，除蛋白，透析得純化多糖；濾液旋轉(zhuǎn)蒸干，復(fù)溶，氯仿萃取，水層調(diào)PH值，通過聚酰胺樹脂柱，乙醇洗脫得純化總黃酮；在總皂苷純化中，選取復(fù)方“前愈”水煎液，石油醚萃取，水層用水飽和的正丁醇溶液進(jìn)行萃取，合并正丁醇旋干，采用濕法裝柱干法上樣的方法通過大孔樹脂柱得純化總皂苷。
　　總多糖部位的純化工藝研究及含量測定，以無水葡萄糖為對照品采用苯酚-硫酸分光光度法測定多糖純度，在復(fù)溶固液比、除蛋白次數(shù)、透

5、析時間三個單因素的試驗基礎(chǔ)上，通過正交試驗優(yōu)選“前愈”多糖最佳純化工藝條件。取6劑前愈處方量(處方組成：生黃芪、淫羊藿、益母草、川黃柏、懷牛膝，共100g)藥材共600g，去離子水浸泡12h，煎煮二次，合并濾液濃縮得“前愈”水煎液，加無水乙醇醇沉過夜，過濾，干燥得粗多糖，加水，臵磁力攪拌器加熱復(fù)溶，離心取上清夜，加入相當(dāng)于1/4體積的Sevag試劑充分?jǐn)嚢?，離心，上清液透析過夜，取出，冷凍干燥，即得純化總多糖。
　　總黃酮部位的純

6、化工藝研究及含量測定，以總黃酮含量為指標(biāo)，采用分光光度法，利用靜態(tài)和動態(tài)相結(jié)合方法，考察純化過程中上樣液質(zhì)量濃度、pH、樹脂藥材比、洗脫溶劑選擇及用量等工藝參數(shù)，對聚酰胺樹脂純化總黃酮部位的行為進(jìn)行評價。將“前愈”水煎液加無水乙醇醇沉，濾過，濾液臵旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋干，加去離子水溶解得生藥質(zhì)量濃度1g·ml-1溶液，氯仿萃取，收集水層，調(diào)pH，通過處理好的聚酰胺樹脂，依次用去離子水、乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，干燥，得純化總黃酮。
　　

7、皂苷部位的純化工藝及含量測定，選用D101大孔樹脂進(jìn)行富集，含量測定采用香草醛-硫酸反應(yīng)。取“前愈”水煎液，石油醚萃取，收集水層，水飽和正丁醇萃取，收集正丁醇臵旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，加入適量處理后的D101大孔樹脂，震搖使藥材完全吸附在樹脂上，旋干，裝柱，然后用去離子水、10%乙醇洗脫除雜，50%乙醇富集總皂苷部位，減壓干燥，得純化總皂苷。
　　慢性非細(xì)菌性前列腺炎大鼠模型的制備，SPF級八周齡雄性 SD大鼠，飼養(yǎng)一周適應(yīng)環(huán)境，采用完全隨

8、機法分組：空白組、模型組、陰性組和給藥組（陽性藥組、水煎液組、總多糖組、總黃酮組、總皂苷組、總多糖+總黃酮組、總多糖+總皂苷組、總黃酮+總皂苷組、總多糖+總黃酮+總皂苷組）。烏拉坦進(jìn)行麻醉，固定，手術(shù)部位消毒，腹腔右下部位切口，暴露前列腺組織，兩側(cè)前列腺分別注射1%角叉菜膠生理鹽水，縫合切口，陰性組注射同等劑量的生理鹽水，空白組不做任何處理，造模后1周，給藥劑量按原水煎液成人服用量、純化前后各化學(xué)部位質(zhì)量及純度進(jìn)行換算，空白組和陰性組給

9、以同等劑量的生理鹽水三周，最后一次給藥后，饑餓，稱大鼠體重、處死，取前列腺組織，稱取濕重，分別做 ELISA分析和組織病理切片，觀察各組大鼠前列腺組織的病理變化和相關(guān)指標(biāo)的改變，評價和篩選“前愈”中總多糖、總黃酮、總皂苷對于治療慢性非細(xì)菌性前列腺炎的有效部位及其組合，探討其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　結(jié)果：
　　為明確復(fù)方“前愈”有效部位和發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，采用色譜學(xué)等技術(shù)，分離其中總多糖、總黃酮及總皂苷三個化學(xué)部位，在動物

10、模型基礎(chǔ)上考察藥效活性。
　　在總多糖純化工藝及含量測定中，考察純化過程中復(fù)溶固液比、除蛋白次數(shù)、透析時間關(guān)鍵技術(shù)對總多糖純度的影響，采用單因素試驗和正交試驗優(yōu)選“前愈”多糖最佳純化工藝條件，即固液比為1:40（g/ml，w/v）、脫蛋白10次、透析18h，此條件下純化多糖純度可達(dá)69.04%，轉(zhuǎn)移率51.84%，工藝流程簡便可行，重復(fù)性好，可以用于復(fù)方“前愈”中多糖部位的純化工藝。
　　在總黃酮部位純化工藝研究及含量測定中

11、，以總黃酮含量為指標(biāo)，采用聚酰胺樹脂考察上樣液質(zhì)量濃度、pH、樹脂藥材比、洗脫溶劑選擇及用量等工藝參數(shù)，確定上樣液質(zhì)量濃度1.0 g·ml-1，pH3.0，5BV水洗脫除雜，4BV50%乙醇洗脫為最佳純化工藝，此工藝條件下，總黃酮純度由8.89%提高到63.67%，純化效果較好，可顯著提高總黃酮純度，工藝條件穩(wěn)定可行。
　　總皂苷部位的純化及含量測定，采用大孔樹脂填充柱，濕法裝柱干法上樣，用去離子水、10%、30%、50%、70%

12、、90%不同濃度的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測定其中總皂苷含量，優(yōu)選去離子水及30%乙醇洗脫除雜，70%乙醇洗脫為最佳工藝，即得純度較高“前愈”總皂苷，純度56.93%。
　　采用角叉菜膠化學(xué)刺激法制備慢性非細(xì)菌性前列腺模型，模型組前列腺指數(shù)明顯升高，且肉眼觀察組織紅腫和周圍組織出現(xiàn)黏連，在病理組織切片中，模型組大鼠前列腺組織出現(xiàn)嚴(yán)重的彌散性慢性炎癥特征，如前列腺上皮高度增加，葉狀乳頭深入腺腔、前列腺側(cè)葉腺腔直徑變小，淋巴細(xì)胞等炎

13、癥細(xì)胞浸潤，表明試驗中大鼠CNP動物模型制備成功，且排除生理鹽水對其炎癥的影響。給藥后，與模型組相比，陽性藥組、“前愈”水煎液、化學(xué)部位及各組合組前列腺組織的炎癥狀況都有所改善，其中，陽性藥組、“前愈”水煎液組及總多糖+總黃酮+總皂苷組改善顯著，腺上皮細(xì)胞排列整齊，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤較少。各項指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，總多糖、總黃酮、總皂苷三種化學(xué)成分對模型組中異常升高的各項細(xì)胞因子具有不同程度的抑制作用，在單個化學(xué)成分給藥時，盡管對于一些細(xì)胞因

14、子有降低作用，但是效果不顯著，如：總多糖可以降低 COX-2、總皂苷可以一定程度上降低iNOS活力和NO含量，總黃酮可以降低PGE2高表達(dá)。在各種化學(xué)成分兩兩配伍給藥中對 TGF-β1、TNF-α、IL-1β、NO含量的影響主要來總黃酮和總皂苷成分，對PGE2、iNOS抑制作用主要來自總多糖和總皂苷成分，對COX-2含量的影響主要來自總多糖和總黃酮成分，三化學(xué)成分配伍使用對 TNF-α、PGE2、IL-1β、TGF-β1、COX-2、i

15、NOS及NO異常升高具有抑制作用。
　　結(jié)論：
　　本實驗通過研究各化學(xué)部位的純化工藝，總多糖純化工藝中，采用水提醇沉，除蛋白、透析法等得純度較高的總多糖，通過聚酰胺樹脂純化總黃酮，采用大孔樹脂濕法裝柱干法上樣，純化得純度較高“前愈”總皂苷化學(xué)部位，然后采用化學(xué)刺激法制備大鼠慢性非細(xì)菌性前列腺炎模型，利用大鼠疾病模型，篩選復(fù)方“前愈”對于治療慢性非細(xì)菌性前列腺炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，三個化學(xué)部位對大鼠疾病狀態(tài)均有不同程度治療作用，