甜菜M14品系特異表達基因M14-341在模式植物中的表達研究.pdf

1、甜菜M14品系為郭德棟等人通過栽培甜菜(Beta vulgaris L．)和野生種白花甜菜(Beta corolliflora Zoss．)種間雜交及回交，獲得的帶有白花甜菜染色體的單體附加系(VV+IC，2n=19)，附加染色體的傳遞率高達96.5％。甜菜M14品系是以二倍體孢子無融合生殖為主要繁殖方式，有性生殖為次要繁殖方式的兼性無融合生殖體。這種具有無融合生殖特性的甜菜M14品系的獲得，為我們提供了一種良好的尋找無融合生殖相關基因

2、的材料。 本實驗室前期采用抑制消減雜交技術(suppression subtractive hybridization，SSH)和mRNA差異顯示技術(differential-display reverse transcription-PCR．DDRT-PCR)獲得了298個甜菜M14品系特異表達的ESTs(expression sequencetags，ESTs)，并挑選其中有研究價值的EST作為獲得全長的侯選EST，通過

3、快速擴增cDNA末端法(rapid amplification of cDNA ends，RACE)獲得了甜菜M14品系特異表達的M14-341基因的cDNA全長。經(jīng)生物信息學分析，M14-341基因編碼的蛋白包括MADS-box結構域和K-結構域，并與菠菜(spinacia oleracea)開花轉錄因子有88％的相似性，可以判定M14-341基因屬于MADS-box基因。 為進一步研究M14-341基因的功能以及M14-3

4、41基因與無融合生殖現(xiàn)象的關系，本實驗首先利用DNAMAN軟件將M14-341蛋白與擬南芥(Arabidopsis thaliana)中部分MIKC族蛋白及其它物種的MADS-box蛋白進行了同源比對，結果表明，M14-341蛋白與擬南芥中AG蛋白同源性達74％，可以將其歸為AG基因(MADS-box基因家族“ABCDE”模型中的C類基因)的同源基因，其功能為控制花器官的發(fā)育。隨后，構建了帶有M14-341基因cDNA全長的植物表達載體

5、pBI-M14-341，分別利用農桿菌介導的葉盤法和花頭浸泡法將M14-341基因轉入模式植物煙草和擬南芥中，以分析轉基因植株的表型變化進而推測M14-341基因的功能。經(jīng)過PCR檢測、RT-PCR、Southern印跡、Northern印跡及GUS染色等分子生物學檢測后，共獲得24株轉基因煙草和12株轉基因擬南芥，進一步研究表明，M14-341基因在轉基因植株花器官中表達量較高，在葉和莖中表達量微弱。 對轉基因植株的表型觀測

6、發(fā)現(xiàn)：M14-341基因在轉基因植株中的組成型表達主要影響了煙草的花期及花器官的發(fā)育，轉基因煙草出現(xiàn)花期延遲，花瓣顏色變淺，數(shù)量變少，花萼與花瓣轉變?yōu)樾廴铩⒋迫镱愃平Y構，雄蕊、雌蕊變長，果實與種子的少育或不育等現(xiàn)象：轉M14-341基因的擬南芥出現(xiàn)結實率降低，死亡率增高等變化。 對轉M14-341基岡煙草花器官與作為對照的未轉基因的野生型煙草花器官的總蛋白進行雙向電泳，結果顯示：轉M14-341基因煙草植株與野生型煙草對照植株