人臍帶沃頓膠和（-）-epicatechin在腦外傷中神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦外傷（Traumatic brain injury，TBI)是由外力的出現(xiàn)對大腦引起的損傷，在世界范圍內(nèi)，腦外傷是致死或致殘的主要病因之一，男性多發(fā)于女性，給社會帶來越來越大的醫(yī)療、護(hù)理負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。大腦中調(diào)控情緒和學(xué)習(xí)記憶的重要部位海馬區(qū)位置表淺，有神經(jīng)再生（neurogenesis）在此發(fā)生，容易在腦外傷中受損，其受損后將會帶來一系列長期并且嚴(yán)重的后果。盡管隨著對此疾病的診斷，治療，護(hù)理以及后期康復(fù)訓(xùn)練等水平的提高，現(xiàn)在仍未發(fā)現(xiàn)

2、一種行之有效的治療方法進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)再生。因此，迫切需要探明腦外傷損傷后病理生理改變機(jī)制，從而獲得一種修復(fù)神經(jīng)損傷并改善神經(jīng)功能，促進(jìn)神經(jīng)再生的治療方法。本文擬用人臍帶沃頓膠和(-)-epicatechin從不同途徑治療腦外傷，觀察這兩種治療方式的治療效果。
　　干細(xì)胞作為新型的一種治療方式，被越來越廣泛的應(yīng)用在腦外傷的治療之中。在眾多不同種類的干細(xì)胞中，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mes

3、enchymal stemcells，hUC-MSCs)具有很強(qiáng)的自我更新和分化能力，來源方便，便于收集，培養(yǎng)和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，同時(shí)應(yīng)用此細(xì)胞治療避免異種移植時(shí)機(jī)體的自我排斥的風(fēng)險(xiǎn)，沒有道德爭議。已有報(bào)道被用來治療腦外傷，取得一定的治療效果。能產(chǎn)生大量hUC-MSCs的臍帶基質(zhì)，沃頓膠（Wharton’s Jelly）組織中富含多種膠原成分和透明質(zhì)酸，形成水凝膠結(jié)構(gòu)，能夠承受擠壓、拉伸等外力，同時(shí)微環(huán)境結(jié)構(gòu)具有支持細(xì)胞生長和充當(dāng)組織支架，目

4、前尚無有關(guān)于應(yīng)用臍帶沃頓膠治療腦外傷的相關(guān)報(bào)道。因此，我們選擇WJ組織治療TBI，觀察損傷大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)，取得很好的治療效果。
　　(-)-Epicatechin(EC)--黃烷醇(Flavanols)的一種，廣泛存在于可可、紅酒、茶、水果和蔬菜中，可激活體內(nèi)的神經(jīng)保護(hù)通路，從而改善機(jī)體氧化防御系統(tǒng)。EC被認(rèn)為是通過激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2（Nuclear factor erythroid2-related factor2 Nrf

5、2）信號通路發(fā)揮功能。Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，通過結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件（Antioxidant response element，ARE），調(diào)控下游的抗氧化蛋白、蛋白酶體、II相解毒酶和分子伴侶等基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠腦出血模型中，EC激活Nrf2/ARE通路，起神經(jīng)保護(hù)作用。在此實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用EC治療小鼠控制性皮層撞擊腦外傷模型（Controlled cortical impact，CCI），發(fā)現(xiàn)EC可

6、明顯改善小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生作用。
　　第一部分人臍帶沃頓膠(Wharton’s Jelly)在腦外傷神經(jīng)修復(fù)作用中的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：
　　建立改良自由落體腦外傷動(dòng)物模型，探索人臍帶沃頓膠移植是否促進(jìn)大鼠腦外傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。
　　方法：
　　應(yīng)用SD大鼠，建立改良自由落體腦外傷動(dòng)物模型。隨機(jī)分為 Sham組，TBI+Vehicle組和TBI+WJ tissu組。腦外傷24小時(shí)后，進(jìn)

7、行WJ組織移植。觀察腦外傷后1天至28天大鼠體重變化，mNSS評分變化。同時(shí)觀察大鼠腦外傷后3天腦水含量的改變，28天時(shí)大腦損傷體和損傷周圍神經(jīng)元的存活情況，以及腦外傷后第14天不同組間BDNF蛋白和mRNA的表達(dá)和TBI后大鼠學(xué)習(xí)記憶功能（新物體識別實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)）的改變。
　　結(jié)果：
　　1. hUC-MSCs的鑒定流式細(xì)胞儀檢測第3代的hUC-MSCs，結(jié)果顯示：CD29和CD44呈高表達(dá)，CD34，CD

8、133，HLA-DR(MHCII)和CD45均呈陰性表達(dá)。
　　2.動(dòng)物模型成功構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)中，共使用98只大鼠，死亡2只。其中TBI+Veh組死亡1只，該組死亡率3.33％（1/33）；TBI+WJ tissue組死亡1只，該組死亡率3.33%（1/33）。
　　3. WJ組織治療TBI減少腦損傷體積TBI后28天，HE染色，Sham組未見明顯損傷，TBI+Veh組損傷體積為16.00±1.14mm3，高于TBI+WJ ti

9、ssue組的12.10±1.28mm3，兩組相比，p<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4. WJ組織治療TBI增加大鼠術(shù)后體重TBI后，大鼠體重在1天，3天減輕，從7天開始體重增加。TBI+Veh組和TBI+WJ tissue組1天，3天，7天，14天和21天各組體重?zé)o明顯變化。28天時(shí)，TBI+WJ tissue組大鼠重量重于TBI+Vehicle治療組（p<0.05）。
　　5. WJ組織治療TBI減輕大腦水含量腦外傷可以

10、顯著增加大腦水含量，3天后，經(jīng)WJ tissue治療，和Vehicle治療組相比，大鼠大腦水含量減少（p<0.05）。
　　6 WJ組織治療TBI改善大鼠運(yùn)動(dòng)功能腦外傷21天和28天后，TBI+WJ tissue組mNSS評分低于TBI+Veh組（p<0.05）。
　　7 WJ組織治療TBI改善大鼠認(rèn)知功能腦外傷28天，在新物體識別實(shí)驗(yàn)中，Sham組的大鼠探索新物體時(shí)間明顯多于舊物體。而在TBI+Veh組中，大鼠探索新、舊物

11、體所用時(shí)間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）。經(jīng) WJ組織治療后，大鼠探索新物體時(shí)間多于探索舊物體所用時(shí)間（p<0.05）。相對于TBI+Veh組中的新物體的辨別指數(shù)，TBI+WJ tissue組辨別指數(shù)中明顯增高（p<0.05）。在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，TBI后26天到28天，TBI+Veh組中的大鼠在正確象限時(shí)間明顯少于Sham組大鼠（p<0.05）。TBI后27天，28天，TBI+WJ tissue組中大鼠在正確象限時(shí)間，明顯高于TBI+V

12、eh組（p<0.05）。在TBI后第24天到28天，大鼠找到平臺所用時(shí)間在TBI+Veh組明顯多于Sham組（p<0.05）。經(jīng)WJ組織治療后，大鼠在TBI后27天和28天中找到平臺所需時(shí)間明顯少于TBI+Veh組（p<0.05）。
　　8. WJ組織治療TBI增加BDNF蛋白和mRNA的表達(dá)腦外傷后14天，BDNF蛋白和mRNA的表達(dá)在 TBI+Veh組中有增高的趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）。經(jīng)WJ組織治療后，和TBI+

13、Veh組相比，BDNF蛋白和mRNA表達(dá)量明顯增高（p<0.05）。
　　9. WJ組織治療TBI增加損傷附近MAP-2陽性細(xì)胞數(shù)腦外傷后28天，在損傷區(qū)域附近，經(jīng) WJ組織治療后，MAP-2陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于 TBI+Veh組（p<0.05）。
　　第二部分(-)-Epicatechin在腦外傷中神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：
　　研究腦外傷后，(-)-epicatechin(EC)是否通過激活N

14、rf2/ARE通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能，是否能促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)再生。
　　方法：
　　使用控制性皮層撞擊模型（Cortical impact model，CCI）模擬腦外傷的發(fā)生。在腦外傷后3h，開始口服EC，每天一次，短期觀察給予3次EC，長期觀察給予7次EC。我們通過大腦損傷體積，腦水腫，白質(zhì)損傷，活性氧（reactive oxygen species，ROS）表達(dá)，運(yùn)動(dòng)功能評，認(rèn)識能力和情緒障礙，以及 Nrf2相關(guān)蛋白表達(dá)等

15、方面評價(jià) EC的神經(jīng)保護(hù)功能。Nrf2基因敲除小鼠被用來判定腦外傷后EC是否通過Nrf2/ARE通路起神經(jīng)保護(hù)作用。用EdU顯色，評價(jià)海馬區(qū)神經(jīng)再生情況。
　　結(jié)果：
　　1. EC治療腦外傷改善小鼠短期運(yùn)動(dòng)功能同時(shí)減少大腦損傷體積腦外傷3天后，EC15mg/kg組降低腦損傷體積。同時(shí)改善從第1天到第3天的小鼠的運(yùn)動(dòng)功能（p<0.05）。其他劑量未能有如此效果，所以選擇此劑量為治療劑量。
　　2. EC長期治療腦外傷減

16、少大腦損傷體積，神經(jīng)元變性壞死，改善神經(jīng)功能恢復(fù)腦外傷后連續(xù)7天給予小鼠EC(15mg/kg)，28天后，EC減少腦外傷后大腦的損傷體積。同樣，和Vehicle組對比，EC長期治療后，改善腦外傷后1天，3天，7天，14天，21天和28天小鼠運(yùn)動(dòng)功能和認(rèn)知功能（神經(jīng)功能缺損評分，前肢放置實(shí)驗(yàn)，掛線實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)、新物體識別實(shí)驗(yàn)）。EC治療可增加小鼠的糖水偏嗜度并減少小鼠懸浮時(shí)間和不動(dòng)時(shí)間，減輕抑郁癥狀(強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn))。腦外傷3天后，

17、PI染色顯示，大腦損傷周圍區(qū)域壞死細(xì)胞由Vehicle組的164.58±9.64減少至EC治療組的118.56±7.16（p<0.05)。FJB染色陽性細(xì)胞代表神經(jīng)元變性壞死，相對于Vehicle組，在損傷區(qū)周圍，EC治療組有更少的FJB染色陽性細(xì)胞數(shù)（p<0.05）。腦外傷后28天，經(jīng)EC治療后，EC明顯增多大腦左側(cè)上半部皮層腦外傷后神經(jīng)元存活個(gè)數(shù)(p<0.05)，具有神經(jīng)保護(hù)功能。此外，腦外傷后3天，經(jīng)EC治療，損傷側(cè)半球腦水含量由

18、79.87±0.40%（Vehicle組）降為78.86±0.17%（p<0.05）。
　　3 EC治療腦外傷減輕腦外傷后白質(zhì)損傷我們用Luxol fast blue染色和MBP染色標(biāo)記大腦白質(zhì)中正常髓鞘。腦外傷28天后，EC治療組Luxol fast blue和MBP染色陽性區(qū)域面積占總面積百分比明顯高于Vehicle組（p<0.05）。
　　4 EC治療腦外傷后減少ROS產(chǎn)生同時(shí)減輕MMP-9活性HEt染色被用來檢測RO

19、S的產(chǎn)生。腦外傷后3天，處死腹腔注射HEt的小鼠，統(tǒng)計(jì)分析熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示，EC治療腦外傷后ROS產(chǎn)生量明顯低于Vehicle組（p<0.05)。經(jīng)EC治療后，腦外傷3天后，MMP-9活性相對于Vehicle組降低51%(p<0.05)。
　　5 EC治療腦外傷后減少蛋白Keap-1表達(dá)同時(shí)增加細(xì)胞核內(nèi)蛋白Nrf2表達(dá)腦外傷3天后，經(jīng)EC治療后，和Vehicle組相比，EC進(jìn)一步降低Keap-1蛋白的表達(dá)量(p<0.05)。在胞

20、質(zhì)中，EC治療腦外傷后，胞質(zhì)Nrf2蛋白未見明顯增多(p>0.05)，但相對于Vehicle治療組，腦外傷3天后，EC增加Nrf2蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)(p<0.05)。
　　6． EC治療腦外傷增加SOD1和NQO1蛋白表達(dá)，降低HO-1蛋白表達(dá)和鐵沉積，未減少大腦血紅蛋白含量。腦外傷3天后，EC治療組的SOD1和NQO1表達(dá)量進(jìn)一步增加，明顯高于Vehicle組(p<0.05)。相反的是，雖然腦外傷后，Vehicle組HO-1蛋白

21、的表達(dá)量明顯增高于Sham組經(jīng)EC治療，EC治療組HO-1表達(dá)量低于Vehicle治療組（p<0.05)。腦外傷3天后，檢測腦組織血紅蛋白含量，發(fā)現(xiàn)在EC治療組和Vehicle治療組的腦中血紅蛋白含量無明顯差異(p>0.05)。檢測腦外傷后3天，腦損傷附近鐵沉積情況，結(jié)果顯示，對比于Vehicle治療組，EC顯著減少損傷周圍鐵沉積(p<0.05)。
　　7. EC治療腦外傷促進(jìn)海馬SGZ區(qū)神經(jīng)再生腦外傷后3天，EC治療組EdU陽性

22、細(xì)胞數(shù)和Ki67陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于Vehicle治療組（p<0.05)。
　　8． EC治療Nrf2基因敲出小鼠腦外傷未明顯減少腦損傷體積和未明顯改善神經(jīng)功能恢復(fù)為驗(yàn)證EC是否在腦外傷后通過Nrf2通路起神經(jīng)保護(hù)作用，我們建立Nrf2基因敲出小鼠CCI模型，觀察EC治療效果。腦外傷28天后，Vehicle治療組的Nrf2基因敲出小鼠和EC治療組的大腦損傷體積無明顯差異(p>0.05)。神經(jīng)功能缺損評分實(shí)驗(yàn)中，腦外傷后3天，7天，1

23、4天和28天，經(jīng)EC治療的Nrf2基因敲出小鼠評分低于Vehicle治療組(p<0.05)。Nrf2基因敲出小鼠腦外傷后，在前肢放置實(shí)驗(yàn)和掛線實(shí)驗(yàn)中，在EC治療組和Vehicle治療組的小鼠未見明顯差異(p>0.05)。在轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中，EC治療組的Nrf2基因敲出小鼠的墜落時(shí)間在第3天長于Vehicle治療組（p<0.05)，但是在其它時(shí)間點(diǎn)，兩組之間未見明顯差異(p>0.05)。腦外傷28天，Nrf2基因敲出小鼠在新物體識別實(shí)驗(yàn)和糖水偏

24、嗜實(shí)驗(yàn)中，EC治療組和Vehicle治療組實(shí)驗(yàn)結(jié)果未見明顯差異(p>0.05)。此外，在懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，腦外傷后，腦外傷增加小鼠的不動(dòng)時(shí)間和懸浮時(shí)間（Vehicle組VS Sham組，p>0.05)，而經(jīng)EC治療后，Nrf2基因敲出小鼠的不動(dòng)時(shí)間和懸浮時(shí)間在EC治療組和Vehicle治療組未見明顯差異（p>0.05)。
　　結(jié)論：
　　腦外傷后，用臍帶沃頓膠治療，可以改善運(yùn)動(dòng)功能和認(rèn)知功能，同時(shí)促進(jìn)BDNF表達(dá)，保