小鼠長髓襻腎單位細段空間走行及超微結構研究.pdf

1、目的：
　　根據(jù)髓襻的襻曲在髓質的位置差異，將腎單位分為短髓襻腎單位(SLN)和長髓襻腎單位(LLN)。其中，LLN的髓襻一直伸入內髓，部分可達到腎乳頭，被認為參與腎髓質高滲梯度的形成，產(chǎn)生濃縮尿，而SLN的髓襻伸入到外髓內帶不同水平。腎髓質高滲梯度的產(chǎn)生與腎髓質的各小管走行、上皮細胞結構及跨膜轉運功能有著密切關系。以往對多種屬動物及人腎組織斷層研究表明，小鼠LLN細段并不是簡單的單層扁平上皮，其超微結構復雜且存在節(jié)段性變化。根據(jù)

2、其細胞游離面的微絨毛形狀及數(shù)量、側面突起的復雜性及緊密連接數(shù)量、基底面質膜內褶及線粒體分布的差異將其分為Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ三種類型。其中，Ⅱ型上皮構成LLN細段降支的上段，Ⅲ、Ⅳ型上皮依次構成LLN細段降支的下段及細段升支。
　　然而，這種傳統(tǒng)的局域斷層組織學研究手段限制了對此區(qū)域內各個小管及血管來源及毗鄰關系的判斷，如髓襻的長短、血管的升降支、髓襻與集合管的辨別等，從而影響對其功能的整體分析。本研究借助計算機圖像處理及程序追蹤技術，并結

3、合經(jīng)典的生物樣本光電鏡切片制備技術，提高了腎髓質各種管腔走行及毗鄰關系研究的效率，并進而在數(shù)字追蹤腎單位、集合管及血管的基礎上，精準研究細段在特定水平的亞細胞結構，結合其上皮的轉運功能，分析其在髓質可能的生理功能或意義。
　　方法：
　　1、腎組織連續(xù)半薄切片的制備
　　三只體重為25g的C57BL/6J小鼠經(jīng)腹主動脈逆流固定后取腎。其固定液為0.1 mol/L的二甲砷酸鈉緩沖液配制的1％戊二醛，PH值為7.4。腎臟在

4、同種固定液續(xù)固定24小時后垂直于腎長軸并經(jīng)腎乳頭取組織塊，鋨酸后固定2h，梯度酒精丙酮脫水，樹脂812包埋。采用超薄切片機及鉆石刀從腎被膜到腎乳頭得到2000張左右連續(xù)的2.5μm厚的半薄切片，再通過甲苯胺藍染色顯示其微細結構。
　　2、腎組織顯維圖像攝取及配準
　　采用顯微圖像攝取系統(tǒng)“Olympus AX70光學顯微鏡-電動載物臺-Olympus DP50數(shù)碼相機-AnalySIS分析軟件”，對每張切片進行拍照。采集的連

5、續(xù)彩色數(shù)字顯微圖像被保存為TIFF格式。圖像配準過程在計算機Windows操作平臺上進行。通過比較相鄰兩幅圖像內生理對應點的像素灰度值的相似性，確定每個圖像沿x軸和y軸平移的距離，以及旋轉角度。為達到生理空間的一致，首先計算相鄰兩幅圖的平移距離和旋轉角度的相對變換值，再求得其相對變換值的相加函數(shù)，從而得到系列圖像中的每幅圖的絕對變換值，實現(xiàn)圖像配準。
　　3、LLN細段數(shù)字追蹤，三維重建并可視化
　　追蹤過程是通過運行C語言

6、編寫的程序，在計算機Linux系統(tǒng)上實現(xiàn)的。具體過程是，在連續(xù)的顯微圖像上，從腎小體尿極起始，沿腎小管至集合管，鼠標點擊管腔斷面，標記為綠色阿拉伯數(shù)字，追蹤結束后，將標記此條小管的綠色阿拉伯數(shù)字變?yōu)榧t色，以區(qū)別正在追蹤的腎小管（綠色）。圖像上具有相同阿拉伯數(shù)字的小管來自于同一個腎單位。追蹤過程自動生成一個數(shù)據(jù)文件(data.dat)，記錄追蹤小管走行的空間坐標。此外，將追蹤過程中識別的小管節(jié)段移行處的坐標手工輸入另一數(shù)據(jù)文件中(segm

7、entdata.dat)，將兩個坐標數(shù)據(jù)文件輸入三維重建可視化軟件中，顯示腎小管的全程走行，且不同節(jié)段賦予不同顏色。
　　4、LLN細段電鏡亞細胞結構分析
　　在三維重建LLN腎單位基礎上，在小鼠腎髓質外髓區(qū)域范圍內，從原始連續(xù)切片中每隔30μm選取要觀察細段相對應的切片，采用樹脂812再包埋，鉆石刀獲取一系列超薄切片（50nm厚）。經(jīng)醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙染色后在透射電鏡下觀察，確定髓襻細段的亞細胞結構，并進行分型。
　

8、　5、LLN細段各型及各亞型長度測量
　　基于追蹤過程自動生成的坐標數(shù)據(jù)集，LLN細段不同類型及同一類型不同亞型節(jié)段的長度測量得以實現(xiàn)。長度的測量運用歐幾里德算法: n∑i=2√(xi-xi-1)2+（yi-yi-1）2+(zi-zi-1)2
　　結果：
　　1、LLN細段由髓襻降支粗段（近端小管直部）的單層立方上皮在外髓外帶與內帶交界處移行為單層扁平上皮而成。其走行一直伴隨在其最終注入的集合管左右。在外髓內帶，細段降

9、支還與髓襻升支粗段相伴行，而在內髓，則與其返折回來的髓襻細段升支相伴行。有趣的是，細段總有一側上皮與毛細血管網(wǎng)相毗鄰。此外，細段降支起始部分（外髓內帶的外側分）高度盤曲，使此段的長度是空間直線距離的2倍;與之伴行的集合管及髓襻升支粗段也在此區(qū)域彎曲走行;此后便直行進入內髓，在內髓不同水平構成襻曲。
　　2、電鏡下觀察:與傳統(tǒng)方法研究結果一致的是，髓襻細段從降支起始到升支細段，再到與髓襻升支粗段相移行部，依次由Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型上皮構

10、成。但采用本研究方法時發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型上皮在走行過程中呈現(xiàn)出規(guī)律性的節(jié)段改變，故而又被分為a、b、c三個亞型。與傳統(tǒng)研究手段更顯優(yōu)勢的是，在三維追蹤基礎上，所有亞細胞結構的分型及亞型都有精準的節(jié)段和長度。
　　簡言之，髓襻降支細段游離面的微絨毛由Ⅱ型上皮的短而鈍，變成Ⅲ型上皮的細而長，到Ⅳ型上皮時消失;側突由Ⅱ型上皮的多而復雜、指狀交錯，并構成細胞間迷路，側面頂端緊密連接清晰可見，到Ⅲ型上皮時的少而簡單，再到Ⅳ型上皮的復雜結構;基底面質

11、膜內褶也由Ⅱ型的多而粗大，且期間可見大量排列的線粒體，到Ⅲ型的細指狀突起，少有線粒體位于期間，再到Ⅳ型的線粒體分布于其基側突中。Ⅱa型上皮分布在起始端彎曲部分，比其它部分要厚而且表現(xiàn)出明顯的極性，隨即，其厚度及復雜性降低并逐漸移行為Ⅱb和Ⅱc型結構簡單的單層扁平上皮。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅳ型上皮起始于細段襻曲前幾十到幾百微米不等的降支。
　　結論：
　　小鼠LLN細段走行有明確的規(guī)律性的區(qū)域特征及毗鄰關系，相一致的是，其區(qū)域性