A549細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)體視學(xué)研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 A549細(xì)胞來源于人肺泡細(xì)胞癌,由Giard D J等于1973年建立。該細(xì)胞既具有肺癌惡性腫瘤細(xì)胞的特性,同時又具有肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的特性和表型。故在研究中A549細(xì)胞被廣泛用于肺癌的發(fā)生、發(fā)展、診斷及治療研究,也被用于正常人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的發(fā)生、分化及其結(jié)構(gòu)和功能的研究。根據(jù)Pubmed查詢,到目前為止,使用A549細(xì)胞進(jìn)行研究的英文報道達(dá)6200余篇；CNKI收錄的利用A549細(xì)胞進(jìn)行研究的中文文

2、獻(xiàn)多達(dá)4600余篇,且中英文獻(xiàn)數(shù)均逐年呈倍數(shù)級上升。然而,這些報道主要集中于A549細(xì)胞功能方面的研究。
　　 眾所周知,細(xì)胞形態(tài)變化是其功能變化的基礎(chǔ),而細(xì)胞功能方面的變化又將影響細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。要想提高對細(xì)胞功能的理解和認(rèn)識必須深化對細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的認(rèn)識。以往對形態(tài)的認(rèn)識和研究多局限于鏡下的定性觀察。然而,對A549細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)研究,無論是光學(xué)顯微鏡之“鏡下所見”,還是掃描電鏡抑或透射電鏡下的超微結(jié)構(gòu)觀察,采用的均為經(jīng)典的視

3、覺描述來反映細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其變化,且都局限于二維水平,缺乏形態(tài)結(jié)構(gòu)的量化概念,缺乏三維結(jié)構(gòu)水平的定量研究。而且由于各種視覺錯覺的作用,如佐勒錯覺和埃賓豪斯錯覺等,有時甚至?xí)贸鐾耆e誤的結(jié)論。從結(jié)構(gòu)形態(tài)來看二維圖像也只是顯示三維結(jié)構(gòu)的各種剖面,例如對于二維切片中的圓形結(jié)構(gòu)并不一定意味著其三維結(jié)構(gòu)為球體,它可能是球體,也可能是橢圓、圓管狀或不規(guī)則結(jié)構(gòu)等。從結(jié)構(gòu)數(shù)量來看,二維圖像一般只能顯示三維結(jié)構(gòu)的一部分,有些結(jié)構(gòu)數(shù)目少,分布不均勻時,

4、在二維圖像中往往看不到。因此,二維圖像上所見的細(xì)胞形態(tài),諸如各種結(jié)構(gòu)的形狀、大小、多少都發(fā)生了變化,單純描述鏡下所見并不全面,也不完善。
　　 體視學(xué)是由二維結(jié)構(gòu)信息定量推論三維結(jié)構(gòu)信息的介于形態(tài)學(xué)與數(shù)學(xué)之間的新興學(xué)科。應(yīng)用體視學(xué)原理最終可測得細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)參數(shù),使人們能從三維水平定量地闡明細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。例如,細(xì)胞中線粒體的體密度能反映出線粒體相對體積大小,線粒體數(shù)密度反映了線粒體數(shù)量多少,線粒體內(nèi)膜表面積密度可反映線粒體內(nèi)膜表面

5、積大小,線粒體的平均自由程則反映出線粒體與線粒體之間的空間平均距離,或者反映了線粒體是密集還是稀少,而線粒體的曲度、球度、軸比等則從不同方面反映了線粒體的形態(tài)等。其他諸如細(xì)胞、核、各種細(xì)胞器及細(xì)胞中的包含物等的三維結(jié)構(gòu)特征都可用相應(yīng)的體視學(xué)參數(shù)來定量描述。
　　 本研究利用光鏡與電鏡拍攝細(xì)胞的圖像,采用圖像分析軟件Image-Pro Plus
　　 6.0對A549細(xì)胞的圖像進(jìn)行分析,并應(yīng)用體視學(xué)的原理和方法,對A549

6、細(xì)胞及其細(xì)胞核內(nèi)的核仁、常染色質(zhì)、異染色質(zhì)以及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的線粒體、溶酶體、板層小體及囊泡等超微結(jié)構(gòu)的三維形態(tài)特征進(jìn)行量化,從三維水平定量揭示A549細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。在研究過程中,我們還對影響參數(shù)結(jié)果的因素進(jìn)行了校正,如細(xì)胞收縮的校正及測試系統(tǒng)的標(biāo)定等。
　　 方法
　　 A549細(xì)胞株和HBE細(xì)胞株由病理教研室液氮保存。
　　 1.A549細(xì)胞光鏡及電鏡制樣收縮系數(shù)測試
　　 (1)分別用等滲重懸、涂片

7、臟染色、涂片巴氏染色、石蠟包埋3μm切片HE染色及透射電鏡制樣半薄(3 μm)切片HE染色5種常規(guī)方法處理細(xì)胞；
　　 (2)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測試每組細(xì)胞的平均直徑,然后以A549培養(yǎng)之等滲重懸細(xì)胞之平均直徑為基準(zhǔn)計(jì)算細(xì)胞的收縮系數(shù)。
　　 2.電鏡圖像“bar”尺長度的誤差分析
　　 (1)用光柵復(fù)型標(biāo)定測試軟件并用軟件按標(biāo)定后的標(biāo)準(zhǔn)尺度測量3500倍、8000倍和15000倍

8、電鏡圖像上對應(yīng)給出的10 μm、5μm和2μ m“bar”尺的真實(shí)長度,用測得的“bar”尺真實(shí)長度與圖像所標(biāo)的長度進(jìn)行比較分析；
　　 (2)計(jì)算電鏡圖像“bar”尺所給的長度與其真實(shí)長度間的絕對誤差和相對誤差,比較不同放大倍數(shù)圖像上“bar”尺所給的長度與其真實(shí)長度間的相對誤差差異程度。
　　 3.A549細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)體視學(xué)研究
　　 (1)透射電鏡下觀察A549細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)并予辨認(rèn)；
　　 (

9、2)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件設(shè)計(jì)測試系統(tǒng),應(yīng)用體視學(xué)原理和方法,測試A549細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的體視學(xué)參數(shù)包括:細(xì)胞核體密度(VVn)、細(xì)胞漿體密度(VVcyt)、細(xì)胞核表面積密度(SVn)、核內(nèi)常染色質(zhì)體密度(VVeuc)、異染色質(zhì)體密度(VVhet)、核仁體密度(VVnu)、核仁表面積密度(SVnu)、線粒體體密度(‰)、線粒體表面積密度(SVmi)、線粒體數(shù)密度(NVmi);溶酶體體密度(VVlys)、溶酶體表

10、面積密度(SVlys)、溶酶體數(shù)密度；板層小體體密度(VVlam)、板層小體表面積密度(SVlam)、板層小體數(shù)密度(NVlam)；囊泡體密度(VVes)、囊泡表面積密度(SVves)、囊泡數(shù)密度(NVves)；細(xì)胞漿平均體積(Vcyt)、細(xì)胞核平均體積(Vn)及平均表面積(Sn)；核仁平均體積(Vn)及平均表面積(Snu)；線粒體的平均體積(Vmi)、平均表面積(Smi)及數(shù)量(nmi)；溶酶體的平均體積(Vlys)、平均表面積(Sl

11、ys)及數(shù)量(nlya)；板層小體的平均體積(Vlam)、平均表面積(Slam)及數(shù)量(nlam)；囊泡的平均體積(Vves)、平均表面積(Sves)及數(shù)量(nves)。上述參數(shù)中的細(xì)胞漿平均體積(Vcyt)、細(xì)胞核平均體積(Vn)及平均表面積(Sn),核仁平均體積(Vn)及平均表面積(Snu),線粒體的平均體積(Vmi)、平均表面積(Smi)及數(shù)量(nmi),溶酶體的平均體積(Vlys)、平均表面積(Slys)及數(shù)量(nlys),板層

12、小體的平均體積(Vlam)、平均表面積(Slam)及數(shù)量(nlam)及囊泡的平均體積(Vves),、平均表面積(Sves)及數(shù)量(nves)是指一個A549細(xì)胞內(nèi)對應(yīng)細(xì)胞器參數(shù)的絕對含量。細(xì)胞核及漿的密度參數(shù)以細(xì)胞為參照空間,核仁、常染色質(zhì)及異染色質(zhì)的密度參數(shù)以細(xì)胞核為參照空間,線粒體、溶酶體、板層小體及囊泡結(jié)構(gòu)的密度參數(shù)以細(xì)胞漿為參照空間。
　　 4.A549細(xì)胞和HBE細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的差異分析
　　 (1)光學(xué)顯微鏡、

13、倒置顯微鏡、掃描電鏡及透射電鏡下觀察A549細(xì)胞和HBE細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)；
　　 (2)通過Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件鼠標(biāo)勾描每幅圖像中的細(xì)胞、細(xì)胞核和核仁的輪廓,分別測試細(xì)胞、細(xì)胞核及核仁的面積和周長,并計(jì)數(shù)細(xì)胞內(nèi)的胞核數(shù)及核內(nèi)的核仁數(shù),以細(xì)胞為參照空間計(jì)算HBE細(xì)胞和A549細(xì)胞核及核仁形態(tài)的體視學(xué)參數(shù):包括細(xì)胞核體密度(VVn)、細(xì)胞核表面積密度(SVn)、細(xì)胞核表面積與體積比(RSVn)、細(xì)胞核數(shù)密度

14、(NVn)、細(xì)胞核平均體積(Vn)、細(xì)胞核平均表面積(Sn)和核漿比(Rnp)；細(xì)胞核仁的體視學(xué)參數(shù)包括核仁體密度(VVnu)、核仁表面積密度(SVnu)、核仁表面積與體積比(RSVnu)、核仁數(shù)密度(NVnu)、核仁平均體積(Vnu)、核仁平均表面積(Snu)共13種體視學(xué)參數(shù)的數(shù)值。
　　 (3)以HBE細(xì)胞核及核仁形態(tài)參數(shù)值為基準(zhǔn),計(jì)算A549細(xì)胞核及核仁形態(tài)的正負(fù)偏離度。
　　 結(jié)論
　　 1.A549細(xì)

15、胞經(jīng)過涂片HE染色、涂片巴氏染色和石蠟包埋3 μm切片HE染色及透射電鏡制樣半薄(3 μm)切片HE染色后會明顯收縮,收縮系數(shù)分別為:66％、67％、69％和71％。處理方式不同,A549細(xì)胞收縮程度不同。
　　 2.電鏡圖像給出的“bar”尺的長度與真實(shí)長度有誤差,相對誤差可達(dá)3％左右；不同放大倍數(shù)“bar”尺的誤差程度不同.
　　 3.A549細(xì)胞其超微結(jié)構(gòu)具有以下量化特點(diǎn)
　　 (1)A549細(xì)胞胞質(zhì)約占細(xì)

16、胞體積的72％,細(xì)胞核約占細(xì)胞體積的28％；以胞核為參照空間,核仁約占8％,染色質(zhì)占92％,而染色質(zhì)中76.9％是以常染色質(zhì)的形式出現(xiàn),異染色質(zhì)約占23.1％；線粒體約占胞質(zhì)的4.6％、板層小體約占胞質(zhì)的2.5％、溶酶體和囊泡各約占胞質(zhì)的1.39％和3.90％。
　　 (2)平均一個A549細(xì)胞內(nèi)約含501個線粒體,其表面積總量為1001.67 μ m2；約含950個板層小體,其表面積總量為428.68 μ m2；約含215個溶