利用基因工程菌HC01固定化細(xì)胞制備D-對(duì)羥基苯苷氨酸.pdf

1、D-型氨基酸在生物界廣泛存在并且具有天然氨基酸所不具備的優(yōu)良性能，在藥物合成、飼料、食品等方面有廣泛的用途。在D-氨基酸的生產(chǎn)中，海因酶法即利用D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶兩種酶連續(xù)催化5'-單替代海因從而生成相應(yīng)的D-氨基酸的方法，由于其低消耗，高產(chǎn)率、高反應(yīng)速率及溫和的反應(yīng)條件而成為工業(yè)生產(chǎn)的首選方法。人們構(gòu)建不同的基因工程菌以期找到適合工業(yè)化生產(chǎn)的菌種，本室已經(jīng)構(gòu)建了一株可以同時(shí)表達(dá)海因酶和水解酶的基因工程菌HC0

2、1，前期的工作為下一步實(shí)驗(yàn)提供了研究基礎(chǔ)。
　　對(duì)一菌兩酶工程菌HC01轉(zhuǎn)化底物DL-對(duì)羥基苯海因(DL-HPH)的最適條件及其細(xì)胞固定化進(jìn)行了研究，HC01游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化DL-HPH的最適條件為40℃，pH7.5。通過對(duì)固定化細(xì)胞酶活力測(cè)定，確定細(xì)胞固定化的最優(yōu)條件為海藻酸鈉濃度2.5％，細(xì)胞濃度為0.029 g/mL，鈣離子濃度為3％。固定化HC01的熱穩(wěn)定性比游離細(xì)胞高5℃，二價(jià)金屬離子Mn2+、Mg2+、Cu2+、Co2+和

3、Ni2+在濃度為0.1 mmol/L時(shí)對(duì)固定化細(xì)胞中D-海因酶(HYD)和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶(CAB)兩酶的活力無顯著影響，Mn2+和Mg2+可分別使游離細(xì)胞中CAB活力提高至原來的2.1和2.7倍。固定化細(xì)胞重復(fù)使用六次后仍然保持80％活力，并且使用十次后小球沒有破裂，在4℃貯存半衰期可達(dá)到12天，顯示了良好的穩(wěn)定性。
　　利用以上固定化細(xì)胞以對(duì)羥基苯海因?yàn)榈孜锷a(chǎn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸，用相當(dāng)于1L菌體活力的固定化細(xì)

4、胞轉(zhuǎn)化1L30 g/L的底物，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，當(dāng)初始pH為9.0，轉(zhuǎn)化溫度為40℃，轉(zhuǎn)速為80 r/min，36小時(shí)后轉(zhuǎn)化率可達(dá)97％左右，反應(yīng)液經(jīng)離心，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用1N HCL酒精重新溶解，過濾后調(diào)pH至7.0即可結(jié)晶得到D-對(duì)羥基苯甘氨酸(D-HPG)，再用95％乙醇洗滌后烘干可得到了光學(xué)純度為99.7％的D-HPG且得率為85％。利用高效液相色譜(HPLC)、核磁共振(NMR)、傅里葉紅外光譜(FT-IR)對(duì)所制備的產(chǎn)物進(jìn)行

5、了表征分析，確定其為D-HPG。
　　外源基因在大腸桿菌中由于過度表達(dá)而易形成包涵體，利用油體蛋白的特性可以對(duì)酶進(jìn)行一步復(fù)性、純化和固定化。本文將油體蛋白基因融合到海因酶基因的C端，將該融合基因分別克隆到pQE30、pET-3a和pET-28a表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)，在pET28a-hydole/BL21中得到了大量表達(dá)的融合蛋白，SDS-PAGE分析主要以包涵體的形式存在，制作人工油體后未檢測(cè)到酶活性，可