組織工程化尿道構(gòu)建及尿道缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)性研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　先天性尿道下裂以及尿道外傷、腫瘤、尿道狹窄等疾病的發(fā)生目前有逐年增高趨勢(shì)，其有效解決辦法還依賴于外科手術(shù)治療。傳統(tǒng)的外科手術(shù)處理，多應(yīng)用自身包皮、陰囊組織原位修復(fù)，或者應(yīng)用頰粘膜、膀胱粘膜等自體組織移植修復(fù)處理。但明顯的缺陷就是容易并發(fā)術(shù)后尿道瘺、尿道再狹窄、尿道結(jié)石等，且對(duì)于再次手術(shù)、尿道缺損較長(zhǎng)的病例，容易因自身修復(fù)材料不足而令臨床醫(yī)生產(chǎn)生治療上的無(wú)奈。
　　隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)和相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，組織工程學(xué)

2、首先在骨科及皮膚科等領(lǐng)域出現(xiàn)并取得了一定的研究進(jìn)展。這也為目前面臨的尿道修復(fù)材料來(lái)源難題提供了一種全新的解決思路。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了該領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)性研究及少部分臨床應(yīng)用的嘗試，取得了一定成就，也不同程度地暴露出了一些問(wèn)題和弊端。特別是在種子細(xì)胞的選擇方面，仍存在不少爭(zhēng)議。
　　研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有多向分化潛能，可定向分化為外胚層的神經(jīng)

3、元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、中胚層的成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞、內(nèi)胚層的肝細(xì)胞等。BMSCs具備與 ECM的良好生物相容性，在組織工程研究中得到了廣泛的應(yīng)用，并首先在組織工程骨組織的構(gòu)建試驗(yàn)中取得了很大的成功。另有研究證實(shí)，干細(xì)胞與尿道上皮細(xì)胞的直接接觸可以誘導(dǎo)其向尿路上皮定向分化，但具體機(jī)制尚不明確。BMSCs的體外分離與培養(yǎng)主要采用以下幾種方式：①貼壁篩選法；②密度梯度離心法；③免疫磁珠篩選法；④流式細(xì)胞儀分選法。
　　尿路上皮細(xì)胞是較難培養(yǎng)的

4、上皮細(xì)胞之一，既往人們?cè)?jīng)認(rèn)為尿路上皮細(xì)胞會(huì)自然衰老凋亡，正常的尿路上皮細(xì)胞可以在體外存活，但時(shí)間短，很難在體外培養(yǎng)、傳代，且無(wú)證據(jù)表明細(xì)胞有數(shù)量的增加。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷完善和細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化，尿路上皮細(xì)胞的培養(yǎng)研究逐步展開(kāi)并不斷獲得成功。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，膀胱來(lái)源的尿路上皮細(xì)胞可在體外培養(yǎng)傳代至3~12代。國(guó)外的研究隨后證實(shí)，人膀胱移行上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方面的研究也獲得了成功。膀胱來(lái)源的尿路上皮細(xì)胞的分離方法有酶消化法、組織塊法及

5、刮削法3種。
　　本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)應(yīng)用干細(xì)胞（骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞）和成體細(xì)胞（尿路上皮細(xì)胞）聯(lián)合脫細(xì)胞基質(zhì)材料的體外培養(yǎng)，并應(yīng)用于長(zhǎng)段尿道缺損的修復(fù)研究。通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以期尋找更為理想的種子細(xì)胞，進(jìn)一步推動(dòng)尿道組織工程的發(fā)展。
　　方法：
　　1.種子細(xì)胞的制備、篩選及鑒定
　　1.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備、篩選與鑒定
　　選取雄性新西蘭白兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，抽取雙下肢骨髓，利用密度梯度離心法分離提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)

6、胞，體外培養(yǎng)、擴(kuò)增、傳代。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD34、CD44的表達(dá)，鑒定確認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。將其作為實(shí)驗(yàn)用種子細(xì)胞之一。
　　1.2尿路上皮細(xì)胞的制備、篩選與鑒定
　　以雄性新西蘭白兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，機(jī)械分離法及酶消化法分離提取膀胱黏膜組織中的尿路上皮細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)、傳代。應(yīng)用免疫熒光法鑒定尿路上皮細(xì)胞表面特異性表達(dá)因子及標(biāo)記物——細(xì)胞角蛋白-18（CK-18）與和尿溶蛋白-2（UP2）的表達(dá)水平，鑒定確認(rèn)尿路

7、上皮細(xì)胞，并作為另外一種實(shí)驗(yàn)用種子細(xì)胞。
　　2.種子細(xì)胞—脫細(xì)胞基質(zhì)材料的復(fù)合培養(yǎng)與標(biāo)記
　　2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）—脫細(xì)胞基質(zhì)的制備
　　選取培養(yǎng)傳代后已接近90％融合的第4代BMSC，加入含有0.2%5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）的無(wú)血清低糖 DMEM溶液培養(yǎng)標(biāo)記，然后應(yīng)用移液器將制備好的細(xì)胞懸液均勻滴加到脫細(xì)胞基質(zhì)粘膜面。聯(lián)合培養(yǎng)制備復(fù)合材料備用。
　　2.2尿路上皮細(xì)胞—脫細(xì)胞基質(zhì)的制備<

8、br>　　選取傳代培養(yǎng)后已接近90%融合的第4代尿路上皮細(xì)胞備用，0.2%5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）共同培養(yǎng)標(biāo)記。應(yīng)用移液器將制備好的細(xì)胞懸液均勻滴加到脫細(xì)胞基質(zhì)粘膜面，聯(lián)合培養(yǎng)制備復(fù)合材料備用。
　　3.尿道缺損模型的制作與修復(fù)
　　3.1尿道缺損模型的制作
　　全麻下游離雄性新西蘭白兔尿道，切除中段尿道長(zhǎng)約3cm，人工制作尿道缺損動(dòng)物模型，備用。
　　3.2尿道缺損的修復(fù)
　　56只雄性成年新西蘭

9、兔，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字法分組，分為4組，每組14只。具體分組及修復(fù)操作如下：
　　A組(無(wú)細(xì)胞對(duì)照組)即：?jiǎn)渭儜?yīng)用異種脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)組。應(yīng)用空白脫細(xì)胞基質(zhì)材料直接制作管狀尿道，用于尿道缺損模型的尿道修復(fù)與重建；
　　B組（假手術(shù)組）即：假手術(shù)對(duì)照組。尿道缺損模型制作成功后，將尿道缺損后的兩個(gè)尿道斷端直接行端端吻合，恢復(fù)尿道連續(xù)性；
　　C組（BMSCs組）即：BMSC復(fù)合異種脫細(xì)胞基質(zhì)手術(shù)修復(fù)組。將BMSCs聯(lián)合脫細(xì)胞基質(zhì)材

10、料聯(lián)合培養(yǎng)后，用于尿道缺損模型的尿道修復(fù)與重建，作為實(shí)驗(yàn)組之一；
　　D組（尿路上皮細(xì)胞組）即：為尿路上皮細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞基質(zhì)手術(shù)修復(fù)組。將尿路上皮細(xì)胞聯(lián)合脫細(xì)胞基質(zhì)材料聯(lián)合培養(yǎng)后，用于尿道缺損模型的尿道修復(fù)與重建，作為另一實(shí)驗(yàn)組。
　　結(jié)果：
　　1．BMSCs呈貼壁式生長(zhǎng)，由短梭形逐漸演變?yōu)殚L(zhǎng)梭形外觀。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)傳代至第4代的BMSC，可見(jiàn)其表達(dá)CD44陽(yáng)性，而CD34的表達(dá)則為陰性，符合間充質(zhì)干細(xì)胞特征；<

11、br>　　2．尿路上皮細(xì)胞呈貼壁式生長(zhǎng)，呈圓形、類圓形外觀，逐漸融合形成鋪路石樣外觀。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示所培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)CK-18與UP2呈陽(yáng)性；
　　3．BMSCs及尿路上皮細(xì)胞接種后脫細(xì)胞基質(zhì)材料透明度降低，細(xì)胞均呈集落樣生長(zhǎng)，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
　　4．四組試驗(yàn)動(dòng)物均全部存活，B組修復(fù)后恢復(fù)最為順利，A組修復(fù)效果最差，C、D組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察至術(shù)后12周修復(fù)效果相當(dāng)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)處理，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：