透析法結(jié)合超濾法去除冷凍復(fù)溫紅細(xì)胞保護(hù)劑的方法研究.pdf

1、為了達(dá)到紅細(xì)胞長期低溫保存的目的，需要添加低溫保護(hù)劑，但在臨床使用時(shí)，需要將保護(hù)劑去除到人體可接受的范圍內(nèi)方可輸注。目前臨床上去除低溫保護(hù)劑的常規(guī)方法是離心法，并且使用的儀器主要是進(jìn)口儀器（比如美國全自動(dòng)紅細(xì)胞處理儀ACP215型），但是離心過程中的機(jī)械應(yīng)力和管部堆積力會(huì)對細(xì)胞造成損傷。因此，本研究將在前期課題組基礎(chǔ)上應(yīng)用透析法結(jié)合超濾法的原理搭建洗滌體系、優(yōu)化洗滌方案并對洗滌效果進(jìn)行研究。
　　目的:為了實(shí)現(xiàn)透析法結(jié)合超濾法去除

2、冷凍復(fù)溫紅細(xì)胞保護(hù)劑體系搭建，洗滌條件的優(yōu)化以及最終對冷凍復(fù)溫紅細(xì)胞進(jìn)行洗滌。本論文將從三個(gè)方面進(jìn)行研究，首先在在前期課題組基礎(chǔ)上應(yīng)用透析法結(jié)合超濾法的原理搭建洗滌體系，洗滌過程中，為了簡單快速的了解甘油濃度變化情況，研究了滲透壓法檢測高甘油濃度冰凍紅細(xì)胞中甘油濃度的可行性;其次因?yàn)闈B透壓的急劇變化會(huì)造成紅細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷，為了優(yōu)化洗滌體系的洗滌條件，研究了不同滲透壓對人紅細(xì)胞體積和溶血的影響;最后根據(jù)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方案洗滌冷凍復(fù)溫的紅細(xì)胞，

3、對洗滌效果進(jìn)行研究，并同ACP215的洗滌效果進(jìn)行比較。
　　方法:洗滌過程中，為了得到滲透壓和甘油濃度的相關(guān)性，用氯化鈉(NaCl)、甘油(C3H8O3)和全血分別制備成不同甘油濃度的鹽水溶液以及紅細(xì)胞溶液，模擬冷凍復(fù)溫紅細(xì)胞洗滌過程中的不同狀態(tài)，用冰點(diǎn)滲透壓儀測定其總滲透壓值，進(jìn)行線性回歸處理與相關(guān)系數(shù)的計(jì)算，并進(jìn)行溶血干擾試驗(yàn)及重復(fù)性試驗(yàn);同時(shí)為了得到不同滲透壓下人紅細(xì)胞體積和溶血的關(guān)系，以梯度濃度的氯化鈉溶液提供不同的滲透

4、壓環(huán)境，加入全血后，離心法測紅細(xì)胞壓積(Hct)，顯微鏡下記錄紅細(xì)胞形態(tài)和直徑，并用冰點(diǎn)滲透壓儀測定上清的總滲透壓，測定上清血紅蛋白(Hb)含量，經(jīng)計(jì)算得到不同滲透壓下的紅細(xì)胞體積及溶血率差異;最后通過調(diào)整洗滌液流速和血液流速，以優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方案洗滌冷凍復(fù)溫的紅細(xì)胞，對洗滌效果進(jìn)行研究，并同ACP215的洗滌效果進(jìn)行比較。
　　結(jié)果:1、在低滲環(huán)境下，當(dāng)滲透壓為148、154、158、171、191和236mOsm/kg時(shí)，溶血率分

5、別為（87.3±4.3）％、（79.4±6.7）％、（68.5±6.6）％、(30.2±2.8)％、（6.6±1.0）％和(2.5±0.8)％，紅細(xì)胞平均體積(MCV)分別為(184.1±32.7)fL、(216.4±62.9)fL、(185.2±27.3)fL、(151.8±6.8)fL、(122.4±3.7)fL和(109.3±2.4)fL;在高滲環(huán)境下，當(dāng)滲透壓為810、1073、2460和3033mOsm/kg時(shí)，溶血率分別為（

6、2.1±0.7）％、(2.5±0.6)％、（25.2±8.7）％和（55.8±13.8）％，MCV分別為(58.1±1.9)fL，(60.6±2.8)fL、(74.5±4.8)fL和(80.1±13.9)fL;在等滲環(huán)境，溶血率為（1.9±0.8）％，MCV為(94.9±1.08)fL。儲存一周的血液和儲存五周的血液總體的變化趨勢相同，只是變化程度略有差異。
　　2、當(dāng)溶液中僅存在甘油和NaCl兩種成分時(shí)，甘油濃度與總滲透壓之間有

7、良好的線性關(guān)系， R2=0.9965。回收率在90％-110％之間。重復(fù)性和穩(wěn)定性的變異系數(shù)小于1％。測定不同甘油濃度的血液樣本時(shí)發(fā)現(xiàn)，甘油濃度與總滲透壓間的線性關(guān)系良好，y=15.253x+219.93，R2=0.9981，回收率較高。重復(fù)性的變異系數(shù)小于2％。干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在游離血紅蛋白為(1.71～15.16) g/L時(shí)，總滲透壓值相差不大。血液混懸液的總滲透壓值與其上清液的總滲透壓值結(jié)果一致，經(jīng)Wilcoxon符號秩檢驗(yàn)分析p

8、=0.156，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、洗滌液和血液流速增加后，滲透壓隨時(shí)間變化的曲線斜率增大，溶液滲透壓能更快的下降，洗滌效率更佳。冰凍復(fù)溫紅細(xì)胞洗滌后發(fā)現(xiàn)透析法結(jié)合超濾法去除冷凍復(fù)溫的冰凍紅細(xì)胞保護(hù)劑之后，其中紅細(xì)胞計(jì)數(shù)回收率為(92.33±5.87)％、血液滲透壓為(291±1.77)Osm/kg，上清游離血紅蛋白為(0.74±0.13)g/L，甘油濃度為（0.24±0.12）g/L，均可達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)。并且同ACP215的

9、方法比較發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)回收率、甘油濃度、上清游離血紅蛋白均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，透析法結(jié)合超濾法在甘油濃度和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)回收率上優(yōu)于ACP215，但是上清游離血紅蛋白含量高于ACP215。
　　結(jié)論:1、滲透壓從低滲到高滲變化過程中，紅細(xì)胞的體積逐漸減小，溶血率先降低后升高，為了使細(xì)胞回收率＞80％，紅細(xì)胞的體積變化需小于1.5倍原體積，大于0.68倍原體積。為了使細(xì)胞回收率＞90％，紅細(xì)胞體積變化需小于1.4倍原體積，大于0.68倍原體