骨髓肌細(xì)胞再生在mdx小鼠中的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:杜興型肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是肌纖維膜抗肌萎縮蛋白(dystrophin)完全缺失導(dǎo)致的一種進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良,為進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良中發(fā)病率最高的類型之一。該病一種X連鎖隱性遺傳的致死性肌病。其主要表現(xiàn)為緩慢進(jìn)行性加重的對稱性肌無力和萎縮,首發(fā)癥狀為骨盆帶肌肌群無力,腓腸肌假性肥大。經(jīng)大量研究,有多種病理生理機(jī)制參與了疾病的形成與發(fā)展,如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、自噬凋亡、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等

2、。無論哪一種改變均可引起肌細(xì)胞的變性壞死,如何修復(fù)變性壞死的肌細(xì)胞,促進(jìn)肌細(xì)胞再生,恢復(fù)肌肉組織的功能成為我們研究的重點(diǎn)。
  mdx小鼠是目前研究肌營養(yǎng)不良的經(jīng)典模型,與DMD患者一樣,mdx小鼠骨骼肌細(xì)胞膜上不表達(dá)dystrophin蛋白。mdx小鼠的組織學(xué)在早期是正常的,在3周左右出現(xiàn)肌細(xì)胞變性壞死,表現(xiàn)出肌無力癥狀,隨著疾病發(fā)展,肌細(xì)胞再生占據(jù)主導(dǎo)地位,病情趨于平穩(wěn),無力癥狀得到改善。而DMD患者肌細(xì)胞再生并不明顯,無力癥

3、狀逐漸加重,最終失去行走能力,甚至死亡。DMD患者與mdx小鼠發(fā)病機(jī)制均為骨骼肌細(xì)胞膜上dystrophin蛋白缺失,但mdx小鼠的臨床表現(xiàn)要比人類輕很多,mdx小鼠肌力低下輕度的原因可能是肌細(xì)胞再生對壞死過程的代償良好所致,可見肌細(xì)胞再生在改善癥狀,延緩病情進(jìn)展方面起到了舉足輕重的作用。
  骨骼肌再生是機(jī)體為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及生長發(fā)育所必需的生理過程。再生過程涉及:骨骼肌細(xì)胞變性壞死,炎癥反應(yīng)的激活,炎癥細(xì)胞因子的釋放,靜止

4、的肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活,成肌細(xì)胞增殖分化形成成熟肌纖維。而肌衛(wèi)星細(xì)胞是參與肌細(xì)胞再生的重要細(xì)胞類型,這些細(xì)胞在激活之后能夠增殖分化成新的肌纖維,是動物出生后骨骼肌生長和肌再生的主要細(xì)胞來源。
  本研究旨在觀察DMD患者與mdx小鼠肌肉組織病理學(xué)差異,研究mdx小鼠骨骼肌細(xì)胞再生相關(guān)基因在不同時(shí)期的差異性表達(dá),以及神經(jīng)細(xì)胞抑制生長因子(Necdin)和腦表達(dá)X-連鎖蛋白1(bex1)基因在mdx小鼠及對照鼠中的表達(dá),探討Necdin、

5、bex1與mdx小鼠肌細(xì)胞再生的相關(guān)性。為進(jìn)一步探討肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活因子相關(guān)基因?qū)I養(yǎng)不良患者治療的可行性提供理論依據(jù)。
  方法:實(shí)驗(yàn)分為兩部分:實(shí)驗(yàn)一,觀察DMD患者及mdx小鼠與對照鼠的肌肉組織在病理組織學(xué)上的特征。實(shí)驗(yàn)二,探索肌再生相關(guān)基因在mdx小鼠不同時(shí)期的差異性表達(dá)。
  實(shí)驗(yàn)一:選取DMD患者及正常人,各三例。所有受試者均經(jīng)光鏡、電鏡檢查后確診。每位受試者均簽署了知情同意書,并對肱二頭肌或股四頭肌或腓腸肌行

6、開放式肌活檢。受試者的活檢肌肉均進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)和免疫組織學(xué)染色。選取雄性C57BL/10ScSn-Dmdmdx/JNju小鼠為實(shí)驗(yàn)鼠,根據(jù)肌肉組織病理學(xué)變化分為2周組、4周組、8周組、12周組。選取雄性C57BL/6ScSn小鼠為對照鼠,同樣分為2周組、4周組、8周組、12周組,每組各3只。以10%水合氯醛(350mg/Kg體重)腹腔注射麻醉,取小鼠雙側(cè)股四頭肌,進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)染色。
  實(shí)驗(yàn)二:實(shí)驗(yàn)鼠與對照鼠的選取、分組及取材同

7、上,每組各3只,分別用于基因表達(dá)譜研究及qRT-PCR檢測。利用基因芯片技術(shù)觀察肌再生相關(guān)基因在mdx小鼠不同時(shí)期的差異性表達(dá),并通過qRT-PCR技術(shù)探索mdx小鼠與對照鼠不同時(shí)期Necdin、bex1基因的表達(dá)情況。并應(yīng)用spss13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
  結(jié)果:
  1 DMD患者肌肉組織的病理學(xué)特征。
  通過常規(guī)染色觀察癥狀早期及終末期的DMD患者的組織病理學(xué)變化。癥狀早期的患者可見肌纖維大小不等,基本呈圓

8、形外觀,可見肌纖維變性、壞死、再生,炎癥細(xì)胞浸潤。終末期患者可見肌肉組織中結(jié)締組織和脂肪組織明顯增生,僅殘存少量肌纖維。免疫組織化學(xué)染色顯示DMD患者Dystrophin蛋白在肌纖維膜上完全缺失。
  2 mdx小鼠肌肉組織不同時(shí)期的病理學(xué)特征。
  通過常規(guī)染色動態(tài)觀察mdx小鼠及對照鼠不同時(shí)期的的組織病理學(xué)變化。2周:mdx小鼠肌肉組織開始出現(xiàn)散在肌纖維的變性壞死及炎癥細(xì)胞的浸潤。同齡對照鼠基本沒有肌纖維的壞死。4周:m

9、dx小鼠出現(xiàn)大量肌纖維的變性及成群肌纖維的壞死,同時(shí)伴有較多炎癥細(xì)胞的浸潤,可見散在以中心核、嗜堿性胞漿為特征的再生肌纖維。同齡正常對照小鼠無上述病理改變。8周:再生肌纖維成群存在,壞死肌纖維散在分布。同齡正常對照小鼠未見明顯再生肌纖維。12周:絕大多數(shù)肌細(xì)胞具有多個(gè)核,且細(xì)胞核逐漸向肌膜周邊分布,肌細(xì)胞趨于成熟。同齡正常對照小鼠無上述病理改變。
  3基因芯片結(jié)果
  (1)聚類分析結(jié)果
  將對mdx小鼠4組樣本得

10、到的差異基因進(jìn)行聚類分析,聚類分析后得到聚類熱圖,每組mdx小鼠樣本均聚類在一起。其中2周組與12周組相比較差異表達(dá)基因較明顯。
  (2)基因篩選結(jié)果
  對2周與12周mdx小鼠股四頭肌組織的基因檢測結(jié)果進(jìn)行比較,取P≦0.05,F(xiàn)ould-Change≧+2,F(xiàn)ould-Change≦-2為篩選基因的條件,差異表達(dá)基因共2928個(gè),與肌細(xì)胞再生相關(guān)的基因約有368個(gè),表達(dá)上調(diào)的基因有271個(gè),表達(dá)下調(diào)的基因有97個(gè)。部

11、分差異基因見表1。其中Necdin基因Fould-Change=10.1611,bex1基因Fould-Change=-2.87293。
  4 Necdin、bex1基因在mdx小鼠及對照鼠骨骼肌細(xì)胞中不同時(shí)期的表達(dá)。
  通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn),Necdin與bex1存在于正常小鼠的骨骼肌細(xì)胞中。與對照組相比,mdx小鼠4周組和8周組股四頭肌中Necdin及bex1基因表達(dá)量升高,mdx2周組表達(dá)量降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

12、義(P<0.05)。在mdx小鼠自身對照中,8周組股四頭肌中Necdin與bex1基因表達(dá)含量最高,與其他組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在正常對照小鼠的自身對照中,2周組股四頭肌Necdin與bex1基因表達(dá)含量最高,與其他組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且隨著時(shí)間延長表達(dá)量逐漸降低。
  結(jié)論:
  1通過DMD患者與mdx小鼠的肌肉組織病理學(xué)觀察,DMD患者的肌纖維的再生遠(yuǎn)不如mdx小鼠明顯。

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