ARFI破壞微泡增強(qiáng)Fe3O4納米粒子在SD大鼠皮下移植瘤靶向遞送的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來，以納米工程為基礎(chǔ)的腫瘤靶向藥物遞送系統(tǒng)發(fā)展迅速，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為納米微粒能延長在血液循環(huán)中停留時(shí)間、逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，同時(shí)由于實(shí)體腫瘤較正常組織所具有的血管豐富、血管壁間隙較寬、結(jié)構(gòu)完整性差、淋巴回流缺失等病理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，納米微?？赏ㄟ^實(shí)體腫瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability andretention effect，EPR效應(yīng))，從血液循環(huán)外滲至腫瘤組織，理論上，納米顆粒與配體或抗體聯(lián)合可以選擇性輸

2、送化療藥物到達(dá)腫瘤靶點(diǎn)，然而靶向納米粒子靜脈注射后在腫瘤組織中的生物分布受到很多因素的影響，如給藥的納米粒子、藥物、藥物測定方法、和其他實(shí)驗(yàn)因素等，實(shí)際上腫瘤部位藥物的實(shí)際累積量通常小于5％，超過90％的注射藥物在血液循環(huán)中即被清除而并沒有聚集在腫瘤內(nèi)。即使納米顆粒隨血液循環(huán)到達(dá)腫瘤部位，由于腫瘤內(nèi)部較周圍組織增高的組織間隙壓力(interstitial fluid pressure，IFP)和更為致密的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)（extracel

3、lular matrix，ECM），想要實(shí)現(xiàn)腫瘤內(nèi)的高效靶向遞送，納米顆粒必須克服腫瘤微環(huán)境的屏障。
　　研究證明，在培養(yǎng)細(xì)胞懸浮液中加入超聲造影劑微泡，在超聲波的輻照下，細(xì)胞膜可對大分子暫時(shí)開放，隨后閉合，大分子可以進(jìn)入細(xì)胞并被細(xì)胞俘獲，這種現(xiàn)象稱為聲孔效應(yīng)[1-3]，利用聲孔效應(yīng)可以增加基因轉(zhuǎn)然效率，導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞表型改變。聲孔效應(yīng)是聲空化所伴隨發(fā)生沖擊波、射流對細(xì)胞共同作用的結(jié)果。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明，超聲波觸發(fā)的微泡破裂，可在超聲

4、波輻照的局部使微泡經(jīng)過的微血管通透性發(fā)生短時(shí)間一過性增加，標(biāo)記紅細(xì)胞、膠體微粒、質(zhì)粒DNA等可以被投遞到超聲波輻照的局部組織中，利用超聲波靶向微泡破壞((Ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD)可明顯增強(qiáng)大分子物質(zhì)在體內(nèi)的高效靶向投遞。與正常組織不同，腫瘤新生血管不僅數(shù)量增多，而且結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)明顯異常，包括血管扭曲、擴(kuò)張、囊泡化、微血管異常吻合及微血管三維空間分布異常，支持內(nèi)皮細(xì)胞

5、的周細(xì)胞數(shù)量減少，基底膜變薄、不連續(xù)，血管壁的通透性增加。理論上這些異常改變有利于微粒通過腫瘤血管壁進(jìn)入腫瘤細(xì)胞間隙。
　　傳統(tǒng)UTMD多采用常規(guī)超聲儀，聲場范圍大，經(jīng)體表輻照使聲場內(nèi)所有微泡爆破，并未達(dá)到真正意義上的精確定位，聲脈沖輻射成像(acoustic radiation force impulse，ARFI)較多的應(yīng)用于組織彈性成像，但ARFI作為一種低強(qiáng)度聚焦脈沖，它較UTMD具有的聚焦特性，更小的輻照范圍使之能夠精確

6、定位微泡爆破的范圍。同時(shí)研究表明，聲輻射力本身作為一種聲驅(qū)動力，在聲波傳播方向上能主動促使微泡由血管腔內(nèi)向血管壁移動，這對于納米粒子的靶向遞送有著重要的作用。
　　本研究通過制備一種Fe3O4納米粒子，基于實(shí)體瘤組織的EPR特征的腫瘤治療策略，實(shí)現(xiàn)納米粒子在血液循環(huán)中較高的遞送，同時(shí)利用超聲波聯(lián)合微泡造影劑產(chǎn)生的空化效應(yīng)，達(dá)到物理方法開放腫瘤生物學(xué)屏障，增加藥物的滲透性達(dá)到物理靶向的作用。這種納米粒子結(jié)合新型影像技術(shù)的物理靶向遞送

7、為腫瘤的靶向治療提供了新的策略和實(shí)驗(yàn)思路。
　　方法及路線:
　　1.制備Fe3O4納米粒子并對其一般性質(zhì)檢測:
　　將所需材料按照一定比例配比，采用高溫水熱法制備Fe3O4納米粒子，調(diào)整各部分材料比例，得到不同大小尺寸的Fe3O4納米粒子，選擇符合實(shí)驗(yàn)需求的Fe3O4納米粒子，用透射電鏡對其進(jìn)行粒徑大小及形態(tài)學(xué)觀察，采用馬爾文激光粒徑儀對其粒徑分布、表面電位進(jìn)行檢測。
　　2.對制備的Fe3O4納米粒子進(jìn)行體外

8、磁共振顯影
　　將制備好的Fe3O4納米粒子分散成不同F(xiàn)e濃度的雙蒸水混懸液，并將其重懸于含瓊脂糖凝膠的離心管中，將上述離心管置于管架上采用7.0T MRI掃描，觀察Fe3O4納米粒子體外磁共振顯影效果。
　　3.建立SD大鼠皮下移植瘤模型
　　將Walker256細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于1640完全培養(yǎng)液，在細(xì)胞增殖處于對數(shù)生長期時(shí)調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL備用。大鼠局部用碘伏消毒，將制備的高濃度細(xì)胞懸液0.5mL注射于

9、大鼠左后腿皮下，觀察大鼠局部皮膚腫脹呈皮丘狀，接種后第7天觀察，并用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
　　4.ARFI破壞微泡增強(qiáng)Fe3O4納米粒子在大鼠皮下移植瘤靶向遞送的實(shí)驗(yàn)研究
　　SD大鼠隨機(jī)分成6組:(1)單純ARFI輻照組(2)單純MBs組(3) ARFI輻照MBs組(4)單純Fe3O4納米粒子組(5) ARFI輻照Fe3O4納米粒子組(6) ARFI輻照MBs和Fe3O4納米粒子組。
　　處理?xiàng)l件:ARFI輻照條件:低頻脈

10、沖聚焦超聲探頭輻照腫瘤部位，間隔5s，累計(jì)輻照5min; MBs:經(jīng)大鼠尾靜脈推注經(jīng)生理鹽水稀釋后的微泡0.2mL; Fe3O4納米粒子:經(jīng)大鼠尾靜脈推注劑量為5mg/kg Fe3O4納米粒子。
　　不同處理組給予相應(yīng)處理，將處理后的SD大鼠腫瘤部位行MRI掃描觀察腫瘤組織信號變化;處死SD大鼠，取組織標(biāo)本行病理學(xué)分析。
　　結(jié)果及結(jié)論:
　　1.制備的Fe3O4納米粒子形態(tài)規(guī)則，粒徑分布均勻，具有磁共振顯像功能。

11、r>　　2.SD大鼠腫瘤組織普魯士藍(lán)染色結(jié)果為單純ARFI輻照組、單純MBs組、ARFI輻照MBs組均未見藍(lán)染顆粒，單純Fe3O4納米粒子組、ARFI輻照Fe3O4納米粒子組、ARFI輻照MBs和Fe3O4納米粒子組均可見點(diǎn)狀藍(lán)染顆粒。其中ARFI輻照MBs和Fe3O4納米粒子組藍(lán)染顆粒計(jì)數(shù)明顯多于其余兩組(P＜0.05)，其中ARFI+MBs+Fe3O4組納米粒子藍(lán)染顆粒最多，藍(lán)染顆粒多分布在血管周圍。
　　3.SD大鼠腫瘤部位

12、磁共振成像結(jié)果為處理前腫瘤在T2*序列上呈現(xiàn)不均勻高信號，部分內(nèi)部可見點(diǎn)狀低信號，考慮為腫瘤局部的壞死灶，單純ARFI輻照組、單純MBs組、ARFI輻照MBs組處理前后均未見明顯信號改變，單純Fe3O4納米粒子組、ARFI輻照Fe3O4納米粒子組、ARFI輻照MBs和Fe3O4納米粒子組經(jīng)相應(yīng)處理后T2*WI均可見腫瘤內(nèi)部低信號部分增加。
　　ARFI輻照MBs能夠有效地提高Fe3O4納米粒子在SD大鼠皮下移植瘤組織的分布，增強(qiáng)F