中藥材DNA及重金屬快檢技術(shù)研究.pdf

1、目的:本課題通過(guò)對(duì)中藥材炮制品DNA快速提取、快速PCR擴(kuò)增以及重金屬含量快速檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行研究，建立了中藥材真?zhèn)渭爸亟饘俸康目焖儋|(zhì)量評(píng)價(jià)體系中的中藥材真?zhèn)舞b別及重金屬含量檢測(cè)，為滿足中藥鑒別現(xiàn)場(chǎng)運(yùn)用系統(tǒng)的快速、簡(jiǎn)單、低毒、高效、靈敏等要求提供技術(shù)支撐。
　　方法:1.以氫氧化鈉，1％PVP40和1％TritonⅩ-100配制成堿裂解緩沖液，Tris-HCl為中和液，經(jīng)加熱裂解和中和兩步對(duì)地黃酒炙品、槐米炒制品以及加入輔料的炮制品

2、進(jìn)行DNA提取并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在該提取方法的基礎(chǔ)上，選擇試劑盒法和Chelex-100法對(duì)槐米炒制品DNA進(jìn)行純化，用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2.通過(guò)對(duì)西紅花及其常見摻偽品的葉綠體基因片段psbA-trnH測(cè)序和比對(duì)分析，找出序列差異，針對(duì)差異堿基設(shè)計(jì)特異性引物，構(gòu)建PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)退火、變性溫度及時(shí)間，減少循環(huán)數(shù)等條件，選擇高效的DNA聚合酶，縮短PCR反應(yīng)時(shí)間，在PCR產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ熒光染料

3、，代替凝膠電泳步驟。3.使用不同金屬離子與探針?lè)磻?yīng)，確定兩種探針的選擇性。使用不同濃度銅離子溶液與兩種探針?lè)磻?yīng)，根據(jù)銅離子濃度與熒光強(qiáng)度值作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定藥材粉末的待測(cè)液與Probe混合液的熒光強(qiáng)度值，計(jì)算出藥材粉末中金屬離子含量。同時(shí)通過(guò)ICP-MS和紫外分光光度法分別測(cè)定該批次藥材中的銅離子含量與總重金屬含量與探針測(cè)量結(jié)果比較。
　　結(jié)果:1.優(yōu)化堿裂解法可簡(jiǎn)單快速的提取出地黃酒炙品、醋炙延胡索、酒炙當(dāng)歸、鹽炙補(bǔ)骨脂、麩炒蒼

4、術(shù)等藥材的DNA。槐米炒制品提取DNA濃度為420.61士123.91μg·μL-1，但槐米炒制品在炒制溫度高、時(shí)間長(zhǎng)的情況下，很難擴(kuò)增出明顯PCR條帶，通過(guò)使用5％ Chelex-100樹脂純化后即可獲得明顯擴(kuò)增條帶。2.建立了基于psbA-trnH序列的西紅花快速真?zhèn)舞b別體系，優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件為90℃預(yù)變性1min，90℃變性5s，58℃延伸5s，26個(gè)循環(huán)。在PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加入染料SYBR GreenⅠ，西紅花正品出現(xiàn)強(qiáng)烈

5、綠色熒光，而偽品無(wú)熒光。3.熒光探針B是針對(duì)于Cu2+的特異性熒光探針。Probe B與不同濃度銅離子混合后，銅離子濃度在0.6-2.4 mg/L范圍內(nèi)顯綠色熒光，當(dāng)濃度大于2.4 mg/L時(shí)，綠色熒光淬滅。在0-2.4 mg/L范圍內(nèi)銅離子濃度與熒光強(qiáng)度比值的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=6.4395x-6.0247，根據(jù)該曲線得出的銅離子濃度與ICP-MS測(cè)出的銅離子濃度進(jìn)行比較，作出曲線y=4.8471x-0921，據(jù)此可以得出藥材中的銅離子含量

6、。4.熒光探針A是針對(duì)與總重金屬離子的含量測(cè)定的熒光探針。Probe A與不同濃度鉛離子混合后均顯藍(lán)色熒光，在0-4.0 mg/L范圍內(nèi)鉛離子濃度與熒光強(qiáng)度比值的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.1165x+0.5413，根據(jù)該曲線得出的鉛離子濃度與紫外分光光度法測(cè)出的總重金屬含量進(jìn)行比較，作出曲線y=1.2335x+28.355，據(jù)此可以得出藥材中的銅離子含量。
　　結(jié)論:優(yōu)化堿裂解法能夠快速、安全的提取中藥材炮制品的DNA;位點(diǎn)特異性PCR方