循環(huán)miRNA及miR-31對原發(fā)性高血壓左室肥厚的影響.pdf

1、第一部分原發(fā)性高血壓左室肥厚患者循環(huán)miRNA的特異性表達
　　目的：探討原發(fā)性高血壓左室肥厚患者循環(huán)miRNA的特異性表達變化，為高血壓左室肥厚的診斷和預測尋找新的生物學標志。
　　方法：入選原發(fā)性高血壓合并左室肥厚及原發(fā)性高血壓不合并左室肥厚患者各5例，采集患者血漿標本并進行miRNA提取，通過高通量二代測序技術檢測兩組患者循環(huán) miRNA表達變化，對測序數(shù)據(jù)進行分析篩選出差異性表達 miRNA，進一步通過生物信息學分析

2、差異表達miRNA的靶基因并進行功能富集分析，初步探討差異表達miRNA的功能。
　　結果：篩選出原發(fā)性高血壓左室肥厚患者差異化特異性表達miRNA共64個，其中35個表達上調(diào)，29個表達下調(diào)；生物信息學分析顯示差異性表達miRNA的功能主要涉及心肌細胞腎上腺素信號、神經(jīng)活化配體/受體相互作用、免疫炎癥反應、脂肪酸代謝等與高血壓左室肥厚密切相關信號通路的調(diào)控，其中hsa-mir-100、hsa-mir-202、hsa-mir-18

3、1a-2、hsa-mir-450b富集的功能最為顯著。結論：原發(fā)性高血壓左室肥厚患者外周循環(huán)中存在特異性miRNA表達譜，可為原發(fā)性高血壓左室肥厚的診斷和預測提供候選生物學標志。
　　第二部分miR-31與LATS2在肥大心肌細胞中的表達變化
　　目的：觀察心肌細胞肥大過程中miR-31與LATS2的表達變化，為后續(xù)實驗提供依據(jù)。
　　方法：體外培養(yǎng)原代大鼠心肌細胞，給予10-6 mol/LAngII刺激構建體外心肌細

4、胞肥大模型，qRT-PCR檢測心肌肥大基因ANP、β-MHC表達，心肌細胞F肌動蛋白熒光探針染色觀察心肌細胞形態(tài)的變化，以確認心肌細胞肥大模型。qRT-PCR檢測心肌細胞肥大過程中miR-31與LATS2的表達變化，Western blot進一步檢測LATS2蛋白表達變化。
　　結果：給予10-6 mol/LAngII刺激成功構建心肌細胞肥大模型，干預2天后即可檢測到心肌細胞肥大基因ANP、β-MHC表達上調(diào)，干預4天后心肌細胞熒

5、光染色顯示心肌細胞表面積明顯增大。伴隨心肌細胞的肥大變化，miR-31表達顯著上調(diào)，而LATS2在基因及蛋白水平均明顯下調(diào)。
　　結論：給予AngII刺激可成功構建心肌細胞肥大模型；伴隨心肌細胞的肥大變化， miR-31表達顯著上調(diào)，而LATS2在基因及蛋白水平均明顯下調(diào)。
　　第三部分miR-31對LATS2及心肌細胞肥大的調(diào)控作用
　　目的：通過下調(diào)肥大心肌細胞中miR-31的表達，觀察miR-31對LATS2及心

6、肌細胞肥大的調(diào)控作用
　　方法：構建miR-31抑制物慢病毒載體(LV-miR-31-inhibitor)，體外感染心肌細胞肥大模型，qRT-PCR檢測肥大基因ANP、β-MHC表達，心肌細胞F肌動蛋白熒光探針染色觀察心肌細胞形態(tài)的變化，監(jiān)測心肌細胞肥大的演變。qRT-PCR檢測心肌細胞肥大演變過程中 LATS2的表達變化，Western blot進一步檢測LATS2蛋白表達變化。
　　結果：LV-miR-31-inhibi

7、tor感染心肌細胞肥大模型可大幅下調(diào)miR-31表達水平，并可促使心肌細胞肥大基因 ANP、β-MHC表達下調(diào)，同時心肌細胞熒光染色顯示細胞表面積明顯減小；伴隨心肌細胞肥大的演變，LATS2在基因水平略有上調(diào)但無顯著差異，而蛋白水平表達卻明顯增加。
　　結論：下調(diào)肥大心肌細胞miR-31表達水平可一定程度逆轉(zhuǎn)心肌細胞肥大，miR-31可能通過作用于LATS2調(diào)控心肌細胞肥大的發(fā)生。
　　第四部分miR-31對LATS2的靶向

8、調(diào)控作用
　　目的：驗證miR-31對LATS2的直接靶向調(diào)控作用。
　　方法：采用雙螢光素酶質(zhì)粒作為工具載體，分別插入 LATS2-3' UTR野生型（LATS2-3' UTR）及突變型（LATS2-3' UTR-MU）基因片段，構建LATS2-3' UTR及LATS2-3' UTR-MU雙螢光素酶基因報告載體。將熒光素酶報告質(zhì)粒及雙螢光素酶空載質(zhì)粒（LATS2-3' UTR-NC）與miR-3l過表達質(zhì)粒及miR-3l空