2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、天南星(Arisaema erubescens(Wall.)、掌葉半夏(Pinellia pedatisecta Schott.)Schott.)和白附子(Typhonium giganteum Engl.)均為天南星科有毒中藥。三種有毒中藥刺激性毒性極為相似,均表現(xiàn)為麻舌而刺喉,具有“戟人咽”的刺激性。誤服均出現(xiàn)口唇及咽喉腫痛、呼吸困難等癥狀,嚴(yán)重情況下出現(xiàn)死亡。正是由于此種毒性,中醫(yī)臨床上以使用其炮制品為主。
  論文作者所在

2、課題組前期已經(jīng)確定天南星、掌葉半夏和白附子中的針晶是三種有毒中藥的主要刺激性毒性物質(zhì),因其晶型特異,可產(chǎn)生嚴(yán)重的刺激性炎癥反應(yīng),故被課題組稱為“毒針晶”。毒針晶可引起家兔眼結(jié)膜強(qiáng)烈水腫、小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)、大鼠足跖腫脹等炎癥反應(yīng)的發(fā)生;前期研究結(jié)果顯示毒針晶呈現(xiàn)針狀,兩頭尖利,表面具有明顯的倒刺和凹槽,這種特異的晶體結(jié)構(gòu)使其可刺入機(jī)體組織,從而引起一系列的炎癥反應(yīng),但其作用機(jī)制尚不明確。
  前期研究發(fā)現(xiàn)毒針晶主要由草酸鈣

3、和蛋白組成,對組成針晶的草酸鈣進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其不具有刺激性作用,而毒針晶中的蛋白成分卻能引起家兔眼結(jié)膜強(qiáng)烈水腫。課題組前期對毒針晶中蛋白進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)針晶中含有能進(jìn)一步誘發(fā)炎癥反應(yīng)的毒性蛋白——“凝集素蛋白”,且發(fā)現(xiàn)天南星、掌葉半夏和白附子的毒針晶中含有的凝集素蛋白即為其生品中的凝集素蛋白。將三種有毒中藥凝集素蛋白提取分離并注射至大鼠腹腔,發(fā)現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞向大鼠腹腔部位遷移聚集,而中性粒細(xì)胞向炎癥部位遷移是炎癥產(chǎn)生的重要標(biāo)志,因此認(rèn)為天

4、南星、掌葉半夏和白附子中的凝集素蛋白均可誘導(dǎo)炎癥發(fā)生,但其為什么可誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生?此作用機(jī)制尚需要進(jìn)行進(jìn)一步研究確定。
  本課題組前期對天南星科有毒中藥天南星、掌葉半夏和白附子的凝集素蛋白的炎癥刺激性在細(xì)胞水平進(jìn)行初步研究,發(fā)現(xiàn)這三種凝集素蛋白誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移的數(shù)量隨著體內(nèi)居留巨噬細(xì)胞數(shù)量的上升而增加,課題組前期曾更深入的對天南星科另一種有毒中藥半夏中的毒針晶及凝集素蛋白進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),半夏的毒針晶及凝集素蛋白均能使巨噬細(xì)胞發(fā)生

5、活化,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子,激活巨噬細(xì)胞內(nèi)重要炎癥信號通路NF-κB(Nuclear factor-kappa B),從而誘導(dǎo)炎癥發(fā)生。天南星、掌葉半夏和白附子,與半夏同屬天南星科,毒性物質(zhì)基礎(chǔ)及引起的炎癥反應(yīng)均與半夏相似,那么,天南星、掌葉半夏和白附子的毒針晶及凝集素蛋白是否也具有致炎作用,而巨噬細(xì)胞在其致炎作用中起到了怎樣的作用?故本論文對半夏以外其他三種有毒中藥天南星、掌葉半夏和白附子毒針晶及凝集素蛋白的致炎作用進(jìn)行研究,提出

6、天南星科有毒中藥天南星、掌葉半夏和白附子的致炎作用與巨噬細(xì)胞密切相關(guān)的假說,深入揭示天南星科有毒中藥天南星、掌葉半夏和白附子的致炎作用的機(jī)制。主要工作內(nèi)容和研究結(jié)果包括以下幾方面:
  1.天南星、掌葉半夏和白附子毒針晶的致炎作用
  采用SEM(Scanning Electron Microscope,掃描電子顯微鏡)觀察經(jīng)天南星、掌葉半夏和白附子三種毒針晶刺激后巨噬細(xì)胞的形態(tài)變化,結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞可吞噬天南星、掌葉半夏和

7、白附子三種毒針晶,當(dāng)毒針晶濃度為6.25μg/mL至12.5μg/mL時(shí),巨噬細(xì)胞活化,體積增大,并產(chǎn)生偽足,但細(xì)胞膜未被破壞;而當(dāng)毒針晶濃度達(dá)到25μg/mL時(shí),巨噬細(xì)胞吞噬作用明顯增強(qiáng),刺激達(dá)2h后,細(xì)胞膜發(fā)生破裂。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明巨噬細(xì)胞確實(shí)參與到天南星、掌葉半夏和白附子三種毒針晶的致炎作用中。
  采用大鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)模型,以TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α)和IL-1β(Interleuk

8、in-1β)為指標(biāo),研究天南星、掌葉半夏和白附子三種毒針晶刺激巨噬細(xì)胞使其釋放炎癥因子的影響,結(jié)果顯示,與空白組相比,不同濃度的三種毒針晶刺激巨噬細(xì)胞1h后,均可引起TNF-α和IL-1β的含量顯著增加,此結(jié)果呈劑量依賴性;刺激1-6h,上升速度較快,刺激6-12h達(dá)到最大值并保持穩(wěn)定。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明天南星、掌葉半夏和白附子三種毒針晶可刺激巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子,引起機(jī)體的炎癥反應(yīng),在掃描電鏡實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,進(jìn)一步表明三種毒針晶的致炎作用與巨

9、噬細(xì)胞相關(guān)。
  采用巨噬細(xì)胞-中性粒細(xì)胞體外共培養(yǎng)遷移模型,研究天南星、掌葉半夏和白附子三種毒針晶刺激巨噬細(xì)胞對中性粒細(xì)胞遷移的影響,結(jié)果顯示不同濃度的三種毒針晶刺激巨噬細(xì)胞1h后,與PBS(phosphate buffered saline)+MΦ(macrophage)組比較,中性粒細(xì)胞遷移數(shù)量增加;而單純的巨噬細(xì)胞和單純的毒針晶本身均不能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,天南星、掌葉半夏和白附子三種毒針晶刺激巨噬細(xì)胞能顯

10、著誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移聚集,表明巨噬細(xì)胞在此過程中發(fā)揮重要作用。中性粒細(xì)胞向炎癥部位遷移是炎癥反應(yīng)發(fā)生的重要環(huán)節(jié),因此,進(jìn)一步證實(shí)三種毒針晶的致炎作用與巨噬細(xì)胞密切相關(guān)。
  上述研究表明天南星、掌葉半夏和白附子三種毒針晶是通過刺激巨噬細(xì)胞使其活化,并激活巨噬細(xì)胞釋放大量炎癥因子,同時(shí)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞向炎癥部位遷移,從而產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果確證了三種毒針晶確實(shí)能夠誘導(dǎo)炎癥毒性,且其致炎作用與巨噬細(xì)胞密切相關(guān)。
  2.

11、天南星、掌葉半夏和白附子凝集素蛋白的致炎作用
  采用SEM觀察經(jīng)天南星、掌葉半夏和白附子塊莖中提取分離出的三種凝集素蛋白AEL、PPL和TGL刺激后巨噬細(xì)胞的形態(tài)變化,結(jié)果顯示天南星、掌葉半夏和白附子三種凝集素蛋白均可活化巨噬細(xì)胞,當(dāng)凝集素蛋白濃度為6.25μg/mL至12.5μg/mL時(shí),巨噬細(xì)胞活化,體積增大,并產(chǎn)生偽足,但細(xì)胞膜未被破壞;而當(dāng)凝集素蛋白濃度達(dá)到25μg/mL時(shí),并刺激巨噬細(xì)胞達(dá)2h后,細(xì)胞膜發(fā)生破裂。該實(shí)驗(yàn)

12、結(jié)果與三種有毒中藥的毒針晶刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥一致,說明凝集素蛋白誘導(dǎo)炎癥發(fā)生與巨噬細(xì)胞相關(guān),也說明毒針晶誘發(fā)的巨噬細(xì)胞活化與毒針晶帶有的凝集素蛋白有關(guān)。
  采用大鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)模型,以TNF-α和IL-1β為指標(biāo),研究天南星、掌葉半夏和白附子三種凝集素蛋白刺激巨噬細(xì)胞使其釋放炎癥因子的影響,結(jié)果顯示,與空白組相比,不同濃度的三種凝集素蛋白刺激巨噬細(xì)胞1h后,均可引起TNF-α和IL-1β的含量顯著增加,此結(jié)果呈劑量依

13、賴性;刺激1-6h,上升速度較快,刺激6-12h達(dá)到最大值并保持穩(wěn)定。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明天南星、掌葉半夏和白附子三種凝集素蛋白能通過刺激巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子從而引起機(jī)體的炎癥反應(yīng),在掃描電鏡實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,進(jìn)一步表明三種凝集素蛋白的致炎機(jī)制與巨噬細(xì)胞相關(guān)。
  采用巨噬細(xì)胞-中性粒細(xì)胞體外共培養(yǎng)遷移模型,研究天南星、掌葉半夏和白附子三種凝集素蛋白刺激巨噬細(xì)胞對中性粒細(xì)胞遷移的影響,結(jié)果顯示不同濃度的三種凝集素蛋白刺激巨噬細(xì)胞1h后,與PB

14、S+MΦ組比較,中性粒細(xì)胞遷移數(shù)量增加,而單純的巨噬細(xì)胞和單純的凝集素蛋白本身均不能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,天南星、掌葉半夏和白附子三種凝集素蛋白刺激巨噬細(xì)胞能顯著誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移聚集,表明巨噬細(xì)胞在此過程中發(fā)揮重要作用。中性粒細(xì)胞向炎癥部位遷移是炎癥反應(yīng)發(fā)生的重要環(huán)節(jié),因此,進(jìn)一步證實(shí)三種凝集素蛋白的致炎作用與巨噬細(xì)胞密切相關(guān)。
  上述研究表明天南星、掌葉半夏和白附子三種凝集素蛋白是通過刺激巨噬細(xì)胞使其活化,并激

15、活巨噬細(xì)胞釋放大量炎癥因子,同時(shí)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞向炎癥部位遷移,從而產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三種有毒中藥能誘發(fā)炎癥反應(yīng)與其帶有的凝集素蛋白刺激巨噬細(xì)胞活化有關(guān),三種有毒中藥的毒針晶被巨噬細(xì)胞吞噬,但誘發(fā)的炎癥反應(yīng)與針晶帶有的凝集素蛋白相關(guān)。
  3.天南星、掌葉半夏和白附子凝集素蛋白的致炎機(jī)制研究
  對天南星科有毒中藥天南星、掌葉半夏和白附子的毒性作用機(jī)制在細(xì)胞及分子水平進(jìn)一步研究,采用Western Blot法,

16、以巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥信號通路NF-κB中單體P65的轉(zhuǎn)核及其抑制劑IκB(I-kappa B)為指標(biāo),觀察天南星、掌葉半夏和白附子三種凝集素蛋白刺激巨噬細(xì)胞前后P65分別在細(xì)胞漿及細(xì)胞核中的表達(dá)水平以及IκB在細(xì)胞漿中的表達(dá)水平,并檢測NF-κB信號通路阻斷劑BAY11-7082對P65入核的影響。結(jié)果顯示不同濃度的三種凝集素蛋白刺激巨噬細(xì)胞1h后,與空白組相比,巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)的P65含量顯著下降,而巨噬細(xì)胞胞核內(nèi)的P65含量顯著上升,并呈

17、劑量依賴性,且NF-κB抑制劑IκB在細(xì)胞漿中表達(dá)升高,呈劑量依賴性。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,天南星、掌葉半夏和白附子三種凝集素蛋白刺激巨噬細(xì)胞誘發(fā)炎癥與巨噬細(xì)胞內(nèi)的信號通路相關(guān),凝集素蛋白能夠激活巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB炎癥信號通路,促使抑制劑從NF-κB上脫落,使巨噬細(xì)胞胞漿中的P65從細(xì)胞漿向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,實(shí)驗(yàn)證實(shí)了三種凝集素蛋白刺激巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥產(chǎn)生的機(jī)制與NF-κB炎癥信號通路相關(guān)。
  將巨噬細(xì)胞在不同濃度的NF-κB信號通路阻

18、斷劑BAY11-7082條件下進(jìn)行孵育后,再用三種凝集素蛋白刺激1h,結(jié)果顯示,與凝集素組相比,BAY11-7082濃度越大,巨噬細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)的P65含量越低,而巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)的P65含量越高,此結(jié)果呈劑量依賴性。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,BAY11-7082能抑制巨噬細(xì)胞胞漿中的P65入核,阻斷三種凝集素蛋白對巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB的激活作用,進(jìn)一步證實(shí)三種凝集素蛋白刺激巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥產(chǎn)生的機(jī)制與激活NF-κB炎癥信號通路密切相關(guān)。
  

19、4.天南星、掌葉半夏和白附子凝集素蛋白對巨噬細(xì)胞死亡模式的影響
  上述實(shí)驗(yàn)已證實(shí)巨噬細(xì)胞與天南星科有毒中藥天南星、掌葉半夏和白附子的毒性作用機(jī)制密切相關(guān),那么巨噬細(xì)胞被刺激后呈現(xiàn)何種死亡模式而引起炎癥反應(yīng)有待研究,可進(jìn)一步深入闡釋天南星科有毒中藥的刺激性毒性機(jī)制。
  采用流式細(xì)胞術(shù),檢測巨噬細(xì)胞經(jīng)天南星、掌葉半夏和白附子三種凝集素蛋白刺激后的死亡模式。結(jié)果顯示,50μg/mL的凝集素蛋白刺激巨噬細(xì)胞1~6h,與空白組相比

20、,1h時(shí)巨噬細(xì)胞發(fā)生早期凋亡,而未發(fā)生壞死;2~6h時(shí),巨噬細(xì)胞發(fā)生早期凋亡的同時(shí)開始出現(xiàn)壞死,并隨著時(shí)間的延長壞死細(xì)胞逐漸增多。證實(shí)了三種凝集素蛋白能誘發(fā)巨噬細(xì)胞發(fā)生壞死從而導(dǎo)致機(jī)體炎癥產(chǎn)生。
  采用透射電鏡法,觀察巨噬細(xì)胞經(jīng)天南星、掌葉半夏和白附子三種凝集素蛋白刺激后的內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)變化來判斷其死亡模式。結(jié)果顯示,50μg/mL的凝集素蛋白刺激巨噬細(xì)胞1~6h,與空白組相比,1h時(shí)巨噬細(xì)胞胞核內(nèi)染色質(zhì)邊集,顯示巨噬細(xì)胞發(fā)生早期

21、凋亡,而未發(fā)現(xiàn)壞死細(xì)胞;2h時(shí),巨噬細(xì)胞發(fā)生早期凋亡的同時(shí)少數(shù)細(xì)胞胞膜破裂,細(xì)胞核裸露,顯示出現(xiàn)壞死細(xì)胞,4h時(shí)壞死細(xì)胞逐漸增多,6h時(shí)壞死細(xì)胞達(dá)到最大值。此實(shí)驗(yàn)與上述流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致,進(jìn)一步證實(shí)了三種凝集素蛋白能誘發(fā)巨噬細(xì)胞發(fā)生壞死從而導(dǎo)致機(jī)體炎癥產(chǎn)生。
  研究進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù),在動(dòng)物體內(nèi)檢測腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞經(jīng)天南星、掌葉半夏和白附子三種凝集素蛋白刺激后的死亡模式。結(jié)果顯示50μg/mL的AEL、PPL和TGL腹腔注射,與

22、空白組相比,巨噬細(xì)胞發(fā)生早期凋亡,并伴隨壞死細(xì)胞的產(chǎn)生,并隨著時(shí)間的延長壞死細(xì)胞逐漸增多。結(jié)果表明,AEL、PPL和TGL在體內(nèi)環(huán)境中也能刺激巨噬細(xì)胞使其發(fā)生壞死。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,證實(shí)凝集素蛋白可刺激動(dòng)物體內(nèi)巨噬細(xì)胞發(fā)生壞死,說明天南星科有毒中藥引起強(qiáng)烈的刺激性毒性作用與其中含有的凝集素蛋白刺激機(jī)體內(nèi)巨噬細(xì)胞活化、早期凋亡至壞死而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)有關(guān)。
  通過上述研究表明,天南星科有毒中藥天南星、掌葉半夏和白附子中的毒針晶及凝集

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