人胚眼來源c-kit+-SSEA4-視網(wǎng)膜祖細(xì)胞生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　視網(wǎng)膜變性（retinal degeneration，RD）是一組視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞或/和光感受器細(xì)胞功能異常所引起的視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞凋亡的致盲性眼病，無法自身修復(fù)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。由于光感受器細(xì)胞無法再生，目前尚無有效的治療方法。視網(wǎng)膜變性疾病的治療是國內(nèi)、外研究的一個熱點(diǎn)問題，目前尚處于探索性研究階段，主要治療方法有基因治療、細(xì)胞移植治療、藥物

2、治療、人工視覺假體等。
　　由于變性的光感受器細(xì)胞無再生能力，移植健康的視網(wǎng)膜細(xì)胞替代或挽救光感受器細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，成為最具前景的治療策略之一，也是最有可能實(shí)現(xiàn)從基礎(chǔ)研究到臨床轉(zhuǎn)化的方法。美國先進(jìn)細(xì)胞技術(shù)（Advanced Cell Technology, ACT）公司獲得美國食品與藥品管理局（ Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)進(jìn)行細(xì)胞移植治療Stargardt病和干性年齡相關(guān)性黃斑

3、變性（Age-related Macular Degeneration，AMD）的Ⅰ/Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果顯示細(xì)胞移植后可以改善或維持部分患者的視功能，這對于細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜變性疾病具有重要意義。
　　目前治療致盲性眼病常用的眼治療細(xì)胞包括來源于胚胎干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，胚胎視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，成體視網(wǎng)膜干細(xì)胞等。
　　雖然胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESC)是臨床轉(zhuǎn)化的理想種子細(xì)胞

4、之一，但仍存在著致瘤性，免疫排斥等風(fēng)險，間充質(zhì)干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞存在分化效率低等問題。
　　組織特異性視網(wǎng)膜祖細(xì)胞（retinal progenitor cell, RPC）具有一定的增殖、分化能力，安全性較高，是較理想的細(xì)胞來源。目前，用于移植的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞多來源于胚胎視網(wǎng)膜或成體視網(wǎng)膜鋸齒緣處潛在的具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞，該群細(xì)胞多未經(jīng)純化，因此移植的細(xì)胞內(nèi)含有多種細(xì)胞或處于發(fā)育不同階段的細(xì)胞群。
　　隨著流式細(xì)胞術(shù)的

5、不斷發(fā)展，為分離純化RPC提供了重要的技術(shù)手段，但通過流式分選純化細(xì)胞，需要應(yīng)用細(xì)胞表面抗原來特異性標(biāo)記分選細(xì)胞，目前對于RPC表面標(biāo)記物的研究較少，因此找到一種可以純化RPC的表面抗原物，將為RPC的研究提供重要幫助。
　　酪氨酸蛋白激酶受體( tyrosinese Kit or CD117 or c-kit)，是位于細(xì)胞膜的識別抗原，具有可進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分選細(xì)胞的優(yōu)勢，在造血干細(xì)胞、肥大細(xì)胞等細(xì)胞中表達(dá)，對于細(xì)胞的生存、增殖和

6、抗凋亡過程中發(fā)揮重要作用。近年研究顯示，c-kit抗原在器官來源的祖細(xì)胞中同樣表達(dá)，并且該類細(xì)胞具有自我更新、形成克隆和多向分化的潛能。肺來源的c-kit+干細(xì)胞移植肺損傷模型后可分化為細(xì)支氣管，肺泡等結(jié)構(gòu)，并整合到宿主體內(nèi)修復(fù)受損組織，心臟中分離出的c-kit+干細(xì)胞，移植后對損傷的心肌組織有修復(fù)作用。
　　在小鼠胚眼視網(wǎng)膜中已發(fā)現(xiàn)存在c-kit+視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，人胚眼視網(wǎng)膜中是否可以分離培養(yǎng)c-kit+視網(wǎng)膜祖細(xì)胞尚未見報(bào)道，本

7、研究擬應(yīng)用c-kit作為表面抗原分選培養(yǎng)該群細(xì)胞，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。
　　在小鼠胚胎早期視網(wǎng)膜中存在c-kit與胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物階段特異性胚胎表面抗原(stage-specific embryonic antigens, SSEA1)雙陽性細(xì)胞，為進(jìn)一步降低致瘤性的風(fēng)險，排除胚眼視網(wǎng)膜祖細(xì)胞中的胚胎干細(xì)胞，本研究中應(yīng)用階段特異性胚胎表面抗原(stage-specific embryonic antigens, SSEA)作

8、為胚胎干細(xì)胞的標(biāo)記，由于SSEA抗原在人ESC中和鼠ESC中表達(dá)不完全一致，人ESC中不表達(dá)SSEA1而是表達(dá)SSEA4，故本研究擬采用c-kit與SSEA4作為表面標(biāo)記物，分選c-kit+/SSEA4-人胚眼視網(wǎng)膜來源的RPC，對該群細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，檢測c-kit+視網(wǎng)膜祖細(xì)胞移植至視網(wǎng)膜色素變性動物模型皇家外科學(xué)院(Royal college of surgeon, RCS)大鼠視網(wǎng)膜下腔后的存活、遷移、分化情況，以及其對

9、光感受器細(xì)胞和視功能的影響，并將c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細(xì)胞移植至嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠皮下進(jìn)行安全性檢測，以期得到純化的人胚眼來源的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，為細(xì)胞移植治療或延緩視網(wǎng)膜變性類疾病提供一種理想的種子細(xì)胞。
　　第一部分不同胎齡人胚眼中c-kit+/SSEA4-細(xì)胞的分布
　　目的：
　　檢測9-16周胎齡人胚眼來源的c-kit+/SSEA4-細(xì)胞在眼組織中的分布。
　　方法：
　　人胚胎來源于第

10、三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院胚胎組織庫，通過雙頂徑和胎兒足長確定胎齡，設(shè)置9-10周組，12-13周組，15-16周組三組，通過對人胚眼冰凍切片行免疫組織化學(xué)染色檢測c-kit+/SSEA4-細(xì)胞在胚眼視網(wǎng)膜中的分布，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同胎齡人胚眼視網(wǎng)膜來源的c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細(xì)胞含量。
　　結(jié)果：
　　1．9-16周胎齡胚眼視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜中均存在c-kit+/SSEA4-細(xì)胞，該群細(xì)胞在視網(wǎng)膜多分布于內(nèi)層，其中

11、周部和周邊部c-kit+/SSEA4-細(xì)胞較后極部視網(wǎng)膜分布多；在脈絡(luò)膜的后極部及周邊部均呈散在分布。
　　2．胚胎9-10周，12-13周，15-16周視網(wǎng)膜c-kit+/SSEA4-細(xì)胞比例分別為2.58±0.35％，4.62±0.60%，4.97±0.99%，9-10周胚胎視網(wǎng)膜c-kit+/SSEA4-細(xì)胞比例低于12-13周胚胎視網(wǎng)膜（P<0.05）及15-16周胚胎視網(wǎng)膜（P<0.05），12-13周c-kit+/SS

12、EA4-細(xì)胞比例與15-16周胚眼視網(wǎng)膜差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．9-10周人胚眼視網(wǎng)膜c-kit+/SSEA4-細(xì)胞比例低于12-13周胚眼視網(wǎng)膜及15-16周胚眼視網(wǎng)膜，12-13周c-kit+/SSEA4-細(xì)胞比例與15-16周胚眼視網(wǎng)膜差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2．人胚眼視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜中均存在c-kit+/SSEA4-細(xì)胞，視網(wǎng)膜內(nèi)c-kit+/SSEA4-細(xì)胞多分布在視網(wǎng)膜內(nèi)層，中

13、周部和周邊部c-kit+/SSEA4-細(xì)胞分布較后極部視網(wǎng)膜多；脈絡(luò)膜上腔的c-kit+/SSEA4-細(xì)胞呈散在分布。
　　3．確定分離培養(yǎng)9-13周人胚胎中視網(wǎng)膜c-kit+/SSEA4-細(xì)胞。
　　第二部分人胚眼c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細(xì)胞增殖分化能力的研究
　　目的：
　　分選培養(yǎng)人胚眼視網(wǎng)膜來源的c-kit+/SSEA4-細(xì)胞，并鑒定其增殖，分化能力。
　　方法：
　　通過對視網(wǎng)膜細(xì)

14、胞分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增，采用流式細(xì)胞術(shù)篩選人胚眼視網(wǎng)膜來源的c-kit+/SSEA4-細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)，細(xì)胞免疫熒光染色，克隆形成實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞增殖周期，繪制增殖曲線等方法，檢測c-kit+/SSEA4-細(xì)胞的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞特性，增殖能力以及分化為視網(wǎng)膜終末細(xì)胞的潛能。
　　結(jié)果：
　　1． c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分選后在呈貼壁和懸浮培養(yǎng)條件下均可存活，貼壁生長條件下細(xì)胞呈單層生長，形態(tài)不規(guī)則，多呈梭型；懸浮培養(yǎng)下

15、以克隆球形式生長。
　　2．c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細(xì)胞表達(dá)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞標(biāo)記物Pax6(91.6±2.7%), Sox2(95.2±2.0%), Rax(94.1±2.5%),和Nestin(98.9±2.8%)，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物(CD11b和CD45)和間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物(CD29和CD140b)。
　　3．c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，82.0±3.1%的細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞增殖標(biāo)記物

16、Ki67，細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示41.13±2.99%的細(xì)胞處于分裂增殖期（S期和G2/M期），增殖曲線顯示c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7天后達(dá)到增殖平臺期，細(xì)胞可增殖20倍以上。c-kit+/SSEA4-細(xì)胞在貼壁和懸浮培養(yǎng)條件下均具有形成克隆的能力。
　　4．在分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)下，c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細(xì)胞在分化條件下可表達(dá)感光前體細(xì)胞特異性標(biāo)記物Otx2（49.9±4.1%)，Crx(5

17、9.9±4.0%)，光感受器細(xì)胞特異性標(biāo)記物recoverin(68.1±5.1%)，rhodopsin(4.0±0.3%)，節(jié)細(xì)胞特異性標(biāo)記物Thy1(29.1±5.4%）及膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物GFAP（66.7±5.8%）。
　　結(jié)論：
　　1． c-kit可作為人胚眼視網(wǎng)膜祖細(xì)胞表面標(biāo)記物，通過流式分選的c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細(xì)胞能傳代培養(yǎng)，并具有視網(wǎng)膜祖細(xì)胞特性。
　　2．人胚眼來源的c-kit+/

18、SSEA4-視網(wǎng)膜祖細(xì)胞具有自我更新能力，克隆形成能力。
　　3.人胚眼來源的c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細(xì)胞具有分化為光感受器細(xì)胞、節(jié)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等視網(wǎng)膜終末細(xì)胞的能力。
　　第三部分人胚眼c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜變性有效性及安全性的研究
　　目的：
　　觀察c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細(xì)胞移植至RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔后的存活、遷移、及分化能力，移植細(xì)胞對光感受器細(xì)胞和視

19、功能的影響，并進(jìn)行安全性檢測。
　　方法：
　　應(yīng)用活細(xì)胞染色標(biāo)記物CM-DiI將分選后的c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細(xì)胞標(biāo)記，將標(biāo)記后的c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細(xì)胞移植至出生后3周的RCS大鼠右眼視網(wǎng)膜下腔（n=9），左眼不進(jìn)行處理，偽手術(shù)組（n=9）右眼注射3μl Hanks鹽平衡液，對側(cè)眼為空白對照組，不進(jìn)行任何處理，分別在移植前和移植后4周，8周，12周行視網(wǎng)膜電圖（Electroretinogram

20、，ERG）檢查，并在預(yù)定的時間點(diǎn)通過免疫組織化學(xué)染色檢測移植細(xì)胞的存活、遷移和分化情況，同時測量各組外核層厚度及移植細(xì)胞表達(dá)光感受器細(xì)胞標(biāo)記物的比例。
　　將12只嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(severe combined immune deficiency，SCID)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組，分別在腹股溝皮下注射c-kit+細(xì)胞和人ESC，觀察12周后，處死小鼠檢測是否成瘤或其他病變。
　　結(jié)果：
　　1．c-kit+

21、/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細(xì)胞在移植后4周，8周和12周少量細(xì)胞向視網(wǎng)膜內(nèi)層遷移，移植細(xì)胞主要存在于視網(wǎng)膜下腔，在4周，8周，12周，分別有1.01±0.11%，2.36±0.25%，5.22±0.14%表達(dá)光感受器細(xì)胞特異性標(biāo)記物recoverin。
　　2．移植治療組視網(wǎng)膜外核層在4周，8周，12周厚度分別為28.43±1.95μm，23.27±0.85μm，19.43±0.84μm，較偽手術(shù)組和空白對照組均增厚(7.67±1.0

22、8μm，8.50±1.47μm)，（6.61±0.65μm,6.83±1.08μm），（4.17±0.75μm,4.80±1.08μm），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3, P<0.01)。偽手術(shù)組和空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　3．ERG結(jié)果顯示在移植前各組b波波幅差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在移植后4周和8周，移植治療組b波波幅高于對照組和未處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），移植后12周各組b波波幅差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

23、P>0.05)。
　　4．致瘤性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組均未出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)組小鼠均未見畸胎瘤形成，陽性對照組出現(xiàn)畸胎瘤，發(fā)生率33.3%。
　　結(jié)論：
　　1．c-kit+/SSEA4-人胚眼視網(wǎng)膜祖細(xì)胞移植至變性大鼠視網(wǎng)膜下腔后可以存活，具有遷移，分化能力。
　　2．c-kit+/SSEA4-人胚眼視網(wǎng)膜祖細(xì)胞對視網(wǎng)膜外核層光感受器細(xì)胞具有一定保護(hù)作用，可以延緩光感受器細(xì)胞凋亡，并改善ERG b波