天然冬蟲(chóng)夏草和發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉的化學(xué)組成及其多糖精細(xì)結(jié)構(gòu)表征.pdf

1、冬蟲(chóng)夏草（Cordyceps sinensis(Berk.) Sace.）是我國(guó)一種珍貴的藥食兩用真菌，具有廣泛的生理活性和獨(dú)特的藥用價(jià)值，其含有多種活性成分，如多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、核苷類(lèi)、蟲(chóng)草酸等。由于天然冬蟲(chóng)夏草的生長(zhǎng)環(huán)境特殊，每年產(chǎn)量有限，無(wú)法滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，因此，國(guó)內(nèi)外眾多研究機(jī)構(gòu)從野生冬蟲(chóng)夏草中分離出菌株，然后結(jié)合固液態(tài)發(fā)酵技術(shù)從而獲得相應(yīng)的發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵產(chǎn)物。但是這些發(fā)酵菌絲體是否與天然冬蟲(chóng)夏草具有相似的化學(xué)組成

2、，是否保持相似的生物活性不得而知。因此，本文綜合采用多種化學(xué)和現(xiàn)代儀器分析方法對(duì)天然冬蟲(chóng)夏草和發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉的化學(xué)組成和活性成分含量（包括水分、灰分、脂肪、多糖、蟲(chóng)草酸和核苷類(lèi)物質(zhì)含量，以及氨基酸組成、脂肪酸組成和礦物元素組成）進(jìn)行了系統(tǒng)且全面的分析和比較。其次，分別提取和純化出天然冬蟲(chóng)夏草和發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉的多糖成分，通過(guò)對(duì)其理化性質(zhì)和化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入分析，為冬蟲(chóng)夏草多糖構(gòu)效關(guān)系的研究奠定理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)將主要研究結(jié)果歸納如下：
　　1.

3、天然冬蟲(chóng)夏草和發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉中最主要的氨基酸為谷氨酸，并且發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉中的必需氨基酸比例較高。天然冬蟲(chóng)夏草主要脂肪酸是油酸（>50％），而發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉的則為亞油酸（42.67%）。除了Cr、Mo、Sn、V和Cd，其他無(wú)機(jī)元素在天然冬蟲(chóng)夏草和發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉中的含量具有顯著性差異。發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉多糖含量最高（10.43%），蟲(chóng)草酸含量最低（4.75%）。此外，發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉中腺嘌呤和腺苷分別為0.5和2.61 mg/g，均顯著高于天然冬蟲(chóng)夏草，兩者

4、鳥(niǎo)苷含量無(wú)顯著性差異，且均未檢測(cè)到蟲(chóng)草素。發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉的水提物具有較好的DPPH、羥自由基清除能力和還原能力。
　　2.干燥處理和貯存過(guò)程對(duì)天然冬蟲(chóng)夏草氨基酸組成和脂肪酸組成無(wú)明顯影響。長(zhǎng)時(shí)間貯存會(huì)導(dǎo)致海藻糖和蟲(chóng)草酸含量均顯著增加，但是對(duì)多糖含量無(wú)顯著影響，而干燥處理導(dǎo)致海藻糖含量顯著增加，多糖含量顯著降低，但是對(duì)蟲(chóng)草酸含量無(wú)顯著影響。新鮮樣品中鳥(niǎo)苷、尿苷、次黃嘌呤和腺嘌呤含量均最高，但是干燥處理和貯存過(guò)程會(huì)導(dǎo)致腺苷含量顯著增加。

5、
　　3.不同產(chǎn)地天然冬蟲(chóng)夏草水提多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似，但是與發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉多糖相比差異顯著。主要包括：a）天然冬蟲(chóng)夏草水提多糖以分子量為960 kDa左右的高分子量組分為主（>60%），而發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉多糖則主要由分子量為28 kDa
　　左右相對(duì)低的組分組成；b）天然冬蟲(chóng)夏草多糖主要由葡萄糖組成，含有少量的半乳糖和甘露糖，而發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成，還有少量的阿拉伯糖和半乳糖醛酸；c）天然冬蟲(chóng)夏草多糖的主鏈主

6、要由1,4-linked Glcp組成，C-6為主要分支點(diǎn)，而發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉多糖的糖苷鍵組成復(fù)雜，主要的糖殘基為1,4-linked Galp和1,4-linked Glcp。天然冬蟲(chóng)夏草和發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉多糖均具有清除 DPPH和羥自由基的能力，以及鐵離子還原能力，這可能是由于酚類(lèi)物質(zhì)、氨基酸等多個(gè)因素共同作用的結(jié)果。
　　4.采用單糖組成、甲基化及氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）分析、特異性糖苷酶水解結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MA

7、LDI-TOF）分析和一維和二維核磁共振波譜（1D/2D NMR）技術(shù)對(duì)天然冬蟲(chóng)夏草水提多糖NCSP-50的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。NCSP-50為α-(1→4)-葡聚糖，分支在C-6位，分子量為9.76×105 Da，推斷其重復(fù)結(jié)構(gòu)單元如下：此處為圖片省略
　　此外，通過(guò)體外RAW264.7細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)證明了NCSP-50是一種與淀粉類(lèi)多糖不同的，具有顯著免疫調(diào)節(jié)作用的活性多糖。
　　5.采用部分酸水解、甲基化及GC-MS分析和

8、1D/2D NMR對(duì)天然冬蟲(chóng)夏草堿提低分子量多糖組分ANCSP-S50（7207 Da）的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。該多糖組分為一種新穎的α-(1→6)-半乳甘露聚糖，主要由甘露聚糖主鏈和半乳呋喃糖短鏈兩部分組成，其中半乳呋喃糖鏈由β-(1→5)-Galf和β-(1→6)-Galf交替連接或β-(1→6)-Galf殘基連接至甘露糖殘基的O-2和O-4，端基為β-T-Galf。甘露聚糖部分是以α-(1→6)-甘露糖殘基線(xiàn)性連接，在O-2和O-4位

9、有分支，其中O-2與α-(1→2)-甘露糖殘基或半乳呋喃糖鏈相連，O-4與半乳呋喃糖鏈相連。由此推斷出這種半乳甘露聚糖的可能結(jié)構(gòu)如下：此處為圖片省略
　　6.通過(guò)甲基化結(jié)合GC-MS分析和1D/2D NMR對(duì)天然冬蟲(chóng)夏草堿提高分子量多糖高分子量組分ANCSP-50的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：ANCSP-50是一種β-(1→3)-葡聚糖，在葡萄糖的C-6位置分支，分子量為4.77×105 Da，特性粘度[η]為2.80 dL/g，

10、推斷可能的結(jié)構(gòu)如下：此處為圖片省略
　　采用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）和靜態(tài)光散射（SLS）,結(jié)合高分子稀溶液理論對(duì)該多糖在不同溶液體系下（0.5 M NaOH和DMSO溶液）的構(gòu)象特征進(jìn)行探討，結(jié)果顯示ANCSP-50在0.5 M NaOH溶液中的Mw、Rg和A2分別為424 kDa、17.3 nm、5.0×10-3 cm3 mol/g2，而在DMSO中分別為2200 kDa、56.7 nm、1.79×10-5 cm3 mol/g2。

11、ANCSP-50在0.5 M NaOH溶液中的Rh為27.9 nm，而在DMSO中形成大的聚集體，表明多糖在0.5 M NaOH溶液可以消除聚集體的形成，得到單分子分布溶液且呈現(xiàn)超支化鏈構(gòu)象。
　　7.單糖組成、甲基化結(jié)合GC-MS分析和1D/2D NMR分析表明發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉多糖是一種主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高分子。因此，在凝膠柱分離的基礎(chǔ)上，繼續(xù)用離子交換柱層析，通過(guò)不同濃度NaCl洗脫，得到的主要組分 CSP

12、2-F0.05，繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行深入分析，從而獲得幾個(gè)可能的連接片段，結(jié)果如下，此處為圖片省略
　　綜上，本文較為系統(tǒng)的比較了天然冬蟲(chóng)夏草和發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉兩種不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草的化學(xué)組成和活性成分含量及其水提物的體外抗氧化活性，同時(shí)對(duì)其不同多糖組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。結(jié)果顯示不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草的化學(xué)成分含量差異明顯，尤其是多糖、蟲(chóng)草酸、腺苷、腺嘌呤等有效成分含量，天然冬蟲(chóng)夏草多糖主要包括α-(1→4)-葡聚糖（NCSP-50），β-(1→3