費(fèi)氏丙酸桿菌維生素B-,12-生物合成基因的克隆和解析.pdf

1、維生素B<,12>是一種哺乳動(dòng)物所必需的維生素，具有廣泛的生理學(xué)作用，但是哺乳動(dòng)物自身卻不能合成，僅有某些特定的微生物才能合成維生素B<,12>如桿菌，沙門氏菌，丙酸菌和假單胞菌。目前，工業(yè)上主要利用脫氮假單胞菌和費(fèi)氏丙酸桿菌進(jìn)行維生素B<,12>的生產(chǎn)。由于費(fèi)氏丙酸桿菌不產(chǎn)生任何毒素，被美國(guó)FDA認(rèn)定為GRAS(Generlly reagard as safe)，其發(fā)酵過(guò)程能耗低，染菌概率小。因此，費(fèi)氏丙酸桿菌在維生素B12的發(fā)酵生產(chǎn)

2、上占據(jù)了越來(lái)越重要的地位。為了詳盡代謝過(guò)程，闡明合成途徑，迄今為止，人們已經(jīng)獲得了大部分費(fèi)氏丙酸桿菌維生素B<,12>生物合成相關(guān)的基因，但是，應(yīng)用費(fèi)氏丙酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B<,12>的生物合成途徑仍不明確。 本研究以費(fèi)氏丙酸桿菌為出發(fā)菌株，克隆、解析了與維生素B<,12>生物合成相關(guān)的部分基因。首先，應(yīng)用遺傳互補(bǔ)法，將費(fèi)氏丙酸桿菌IFO12424株的染色體基因文庫(kù)，電擊轉(zhuǎn)化到Salmonella typhimurium Co

3、bⅢ領(lǐng)域的缺失突變株TT10858中，進(jìn)行P.freudenreichi CobⅢ領(lǐng)域維生素B<,12>生物合成基因的篩選，結(jié)果得到了4206bp的DNA片段，命名為P4。解析結(jié)果表明，該片段包含了一個(gè)部分的和三個(gè)完整的讀寫框，依次為編碼L-蘇氨酸-O-3-磷酸鹽脫羧酶的cobD，編碼腺苷鉆啉酰胺(AdoCbi)激酶和AdoCbi-P鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶的cobU，負(fù)責(zé)催化AdoCbi-GDP與α-ribazole連接，完成腺苷鈷胺素(AdoC

4、bI)最終合成的cobS，及編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的cobR。 然后，根據(jù)所得cobD的堿基序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，應(yīng)用LA PCR<'TM> in vitro Cloning Kit，獲得了cobD上游3290bp的序列信息，命名為P3。經(jīng)序列分析，發(fā)現(xiàn)此片段包含了編碼鈷啉酸a，c-二酰胺合成酶的cbiA、負(fù)責(zé)傳遞腺苷將鈷啉胺酸a，c-二酰胺轉(zhuǎn)化生成腺苷鈷啉胺酸a，c-二酰胺的cobA，催化腺苷鈷啉胺酸a，c-二酰胺酰胺化生成腺苷鈷啉胺

5、酸的cbiP以及cobD的上游區(qū)域。 最后，將兩者合并后得到全長(zhǎng)為7308bp的DNA片段，命名為P7。經(jīng)ORF檢索和同源性分析，發(fā)現(xiàn)此片段包含了一個(gè)部分ORF和5個(gè)完整的ORF，依次為cbiP，cobA，cbiA(cbiA-cobD)，cobU，cobS和cobR，它們編碼的蛋白負(fù)責(zé)催化費(fèi)氏丙酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B<,12>過(guò)程中，從鈷啉胺酸a，c-二酰胺到最終AdoCbI的生成。因此，發(fā)現(xiàn)這些基因?yàn)樘剿髻M(fèi)氏丙酸桿菌維生素B<