犬類microRNA的計(jì)算機(jī)鑒定及分析.pdf

1、微小RNA(microRNA)是近年來在動(dòng)植物以及病毒中被廣泛研究的一類長度為18-25nt的非編碼小分子RNA。許多研究表明，這些microRNA(miRNA)作為一種真核生物體內(nèi)的重要的調(diào)節(jié)因子，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，幾乎涉及到了所有的細(xì)胞水平方面的功能。由于目前在各個(gè)物種中所鑒定的microRNA的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及理論上的飽和值，所以對microRNA的分離鑒定依然是microRNA研究的一個(gè)熱點(diǎn)?？茖W(xué)家在2001年便完成了

2、對狗基因組的測序，而且通過全基因組比較分析，發(fā)現(xiàn)人與犬類基因組具有相似的核苷酸差異水平，為研究人類相關(guān)疾病提供了一個(gè)很好的平臺，同時(shí)犬類物種間具有很大的表型多樣性。最為重要的是，目前在miRNA數(shù)據(jù)庫(miRBase)中只報(bào)道了6個(gè)miRNA基因。以上這些都為在犬類基因組中鑒定miRNA提供了理論平臺和現(xiàn)實(shí)意義。 由于miRNA具有時(shí)空表達(dá)特異性，以及mRNA的降解產(chǎn)物和其它非編碼RNA的干擾，所以采用實(shí)驗(yàn)RNA組學(xué)的方法具有一

3、定的局限性。因而我們這里采用計(jì)算機(jī)RNA組學(xué)的方法利用成熟miRNA的序列保守性以及前體結(jié)構(gòu)具有發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)的性質(zhì)在犬類基因組中鑒定出357個(gè)miRNA分子，現(xiàn)將研究結(jié)果小結(jié)如下： 1．所鑒定的357個(gè)miRNA序列分布在犬類的33條染色體，其中在基因組中屬于單拷貝的序列是281個(gè)，屬于多拷貝的序列是35個(gè)；分布在基因間隔區(qū)的序列是222個(gè)；分布在內(nèi)含子中的序列是125個(gè)，其中與基因鏈互補(bǔ)的序列有75個(gè)，與基因鏈反向的有50個(gè)；

4、分布在外顯子上的序列是6個(gè)；分布在非翻譯區(qū)(UTR)上的序列是3個(gè)。所有前體序列長度從65到120個(gè)核苷酸長度，平均長度在80個(gè)核苷酸左右。 2．通過mfold分析所有預(yù)測的序列的所在基因組位點(diǎn)是否能夠形成符合miRNA標(biāo)準(zhǔn)的二級結(jié)構(gòu)。折疊結(jié)果表明：絕大多數(shù)序列能夠形成典型的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。狗基因組中與人同源的miRNA由于在人類中已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)可以穩(wěn)定表達(dá)。同時(shí)通過EST數(shù)據(jù)庫搜索發(fā)現(xiàn)8個(gè)新的miRNA可以穩(wěn)定表達(dá)。而且我們對其中

5、5個(gè)新的miRNA分子進(jìn)行RT-PCR分析，兩個(gè)microRNA分子得到預(yù)期條帶，說明可以穩(wěn)定表達(dá)。 3．通過分析發(fā)現(xiàn)狗基因組中這300個(gè)與人miRNA具有同源的序列形成149個(gè)家族，其中miR-154、miR-17和let-7家族分別含有15、13和10個(gè)成員。大多數(shù)家族中只含有一個(gè)成員。這與植物miRNA形成家族的形式完全相反。動(dòng)物家族間的成員在序列上呈現(xiàn)出三種形式：成員問呈現(xiàn)多拷貝形式，或者是成員間序列上是相似的，又或者是

6、他們具有同源性。 4．利用啟動(dòng)子分析軟件對所有的miRNA進(jìn)行了分析，最后鑒定出了142個(gè)miRNA形成了53個(gè)簇，由上游的啟動(dòng)子控制表達(dá)，其中28個(gè)簇由多個(gè)同源的miRNA基因組成，18個(gè)miRNA簇形成8個(gè)不同的同源簇。進(jìn)一步的分析表明有些簇是通過重復(fù)的形式產(chǎn)生多拷貝。 5．研究結(jié)果表明8號染色體上存在一個(gè)與人具有高度同源的印跡區(qū)域，在這個(gè)區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個(gè)最大的由41個(gè)miRNA組成的miRNA基因簇，另外兩個(gè)簇則位于該

7、簇的上游，分別是由5個(gè)miRNA組成的基因簇以及C/D snoRNA基因簇。進(jìn)一步分析表明這最大的microRNA基因簇由三個(gè)基因家族組成，這三個(gè)家族分別是由不同的microRNA通過串聯(lián)重復(fù)而產(chǎn)生的。 6．研究發(fā)現(xiàn)，15個(gè)miRNA位于基因組的重復(fù)區(qū)域。其中7個(gè)位于LINE元件中，其它大多數(shù)位于SINE中。它們有些完全位于重復(fù)元件內(nèi)，有些則與元件部分重疊。而且還有2個(gè)miRNA位于rRNA基因的內(nèi)含子中。 7．通過分

8、析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)miRNA在動(dòng)物的進(jìn)化過程中都是保守的。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)miRNA是通過局部串聯(lián)重復(fù)以及非局部重復(fù)形式而進(jìn)化的。串聯(lián)重復(fù)在鄰近區(qū)產(chǎn)生多個(gè)拷貝，而非局部重復(fù)發(fā)生在不同染色體之間，從而產(chǎn)生基因或者基因簇的遷移。 8．對所鑒定的miRNA靶序列的預(yù)測分析表明，大多數(shù)miRNA所調(diào)節(jié)的靶序列參與了幾乎生物體所有的細(xì)胞過程，比如生長發(fā)育、代謝、調(diào)控因子的調(diào)節(jié)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用等等。其中參與的最多的功能可能是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。同