95條新的水稻microRNA的計(jì)算機(jī)鑒定.pdf

1、miRNAs(MicroRNAs)約22nt的小非編碼RNA在不同的動(dòng)物和植物中被發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)它與基因表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控及個(gè)體發(fā)育過程都有關(guān)系，因此，miRNAs的研究可能對(duì)基因功能研究、人類疾病防治及生物進(jìn)化探索具有重要意義。但是，其本身還有很多未解之謎，比如其調(diào)控機(jī)制和在其它方面的作用。如今，miRNA都是由克隆測(cè)序，Northern bloting驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)的。這種傳統(tǒng)的方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且由于miRNA具有序列非常短、特異性表達(dá)、

2、不同miRNA表達(dá)量差異很大等特點(diǎn)使得用傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法來尋找miRNA非常困難。因此尋找新的miRNA成為了進(jìn)一步研究miRNA功能的首要任務(wù)。目前已有一些計(jì)算機(jī)方法預(yù)測(cè)的報(bào)道，這些方法大多基于已知的miRNA運(yùn)用同源比對(duì)的方法來尋找新的miRNA。其優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確性高能夠大量發(fā)現(xiàn)與已知miRNA同源的新miRNA，但是對(duì)部分物種特有的miRNA就無能為力了。我們?cè)趯ふ倚耺iRNA的研究中，將生物信息學(xué)與實(shí)驗(yàn)的結(jié)合，并結(jié)合自己的實(shí)踐提出了一些

3、具有原創(chuàng)性的方法。極大地提高了在基因組中尋找miRNA的效率和準(zhǔn)確性。本研究在同源方法尋找miRNA的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)展了非同源性尋找方法。使用這種方法，我們發(fā)現(xiàn)了136條microRNA其中包括41條已知的水稻microRNA，還有一些在擬南芥和其他物種中保守。這95個(gè)新的miRNAs分別屬于水稻12條染色體的81個(gè)家族。 我們的方法主要是通過分析已知miRNA及其前體的序列結(jié)構(gòu)特征，提取出其特征值。以此特征值為基礎(chǔ)比較未知m

4、iRNA的前體序列結(jié)構(gòu)特征，符合這些特征的我們就認(rèn)為很可能是miRNA。然后再配合靶目標(biāo)分析，如果有匹配的靶目標(biāo)，可初步認(rèn)定為miRNAs。最后將獲得的miRNAs與已知miRNA比較，可得到新的miRNAs。對(duì)于新獲得的miRNA我們還分析了其在其他物種中的保守，結(jié)果發(fā)現(xiàn)我們的方法預(yù)測(cè)到的miRAN在其他物種里的保守性低于已知miRNA的保守性。對(duì)miRNA的靶目標(biāo)基因的分析，也讓我們知道了更多種類的基因能夠被miRNA調(diào)控。我們還挑

5、選了5條新的miRNA在水稻幼苗中用realtimePCR檢測(cè)，結(jié)果檢測(cè)出3條新的miRNA，這說明我們預(yù)測(cè)的miRNA能夠表達(dá)，這也驗(yàn)證了本研究方法確實(shí)可靠。預(yù)測(cè)中我們運(yùn)用了EST數(shù)據(jù)過濾，表明我們預(yù)測(cè)出的新的miRNA能夠表達(dá)的，這也從另一個(gè)角度證明本研究方法確實(shí)可靠。但與此同時(shí)，可能也有許多真正的miRNA往往被忽略，因?yàn)榕d應(yīng)得EST可能沒有被發(fā)現(xiàn)或沒有登陸于EST數(shù)據(jù)庫(kù)中。因此，我們還需進(jìn)一步研究，來將這些miRNA也識(shí)別出來。

6、另一方面，我們還建立了一種快速高效的土壤微生物RNA提取方法。在RNA的提取過程中應(yīng)用到了Mg<'2+>K<'+>-Na<'+>-皂土，氯仿，異丙醇，高濃度KI，2-巰基乙醇等試劑，從而有效地去除了RNA提取過程中的包括RNase的蛋白質(zhì)，腐殖酸，多糖和多酚等污染。用改良的皂土法對(duì)三種不同土壤進(jìn)行RNA提取。能夠從0.2g的土壤樣品中提取出8~12 μg的總RNA。RNA提取物的A260/A230和A260/A280比值分別為1.5~1