用于細胞生理特性研究的新型熒光探針的研制與應(yīng)用.pdf

1、生命活動是由各種生物活性物質(zhì)參與，相互關(guān)聯(lián)、相互制約的眾多化學(xué)反應(yīng)的總結(jié)果。許多生物活性物質(zhì)與氨基酸、蛋白質(zhì)或其它有機基團結(jié)合，發(fā)揮各種各樣的生物學(xué)作用、特殊的生理功能和高度的生化效應(yīng)。其中，氫離子和活性氧自由基是兩種重要的生物活性物質(zhì)。 氫離子濃度作為一個重要的新陳代謝及細胞內(nèi)的參數(shù)，在許多細胞內(nèi)的過程中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。許多報道認(rèn)為一些疾病與細胞質(zhì)或者酸性細胞器內(nèi)的pH異常有關(guān)。因此，精確測量細胞內(nèi)的pH非常重要。目前，

2、許多方法可用于檢測pH．這些方法包括微電極、核磁及熒光光譜方法。其中，熒光法由于其非破壞性、高的靈敏度和專一性、以及廣泛可用的熒光染料在測定pH時比其他方法更具優(yōu)越性。而且，熒光顯微成像技術(shù)通過使用熒光pH探針能夠描繪出活體細胞內(nèi)氫離子的時空分辨。 目前，兩類熒光pH探針得到開發(fā)應(yīng)用：一類是用于檢測pH范圍大約是6.8-7.4的細胞質(zhì)內(nèi)pH的探針：另一類是用于檢測酸性器官如溶酶體、內(nèi)涵體等的探針，這些酸性器官pH范圍大約是4.

3、5-6.0.由于細胞內(nèi)pIq的微小變化可能導(dǎo)致細胞的功能紊亂，因此理想的pH熒光探針應(yīng)當(dāng)靈敏的響應(yīng)細胞內(nèi)pH的微小變化，并且能夠避免來自生物細胞本身的干擾。然而，目前可用的pH熒光探針有以下缺點：低的靈敏度，有的激發(fā)在紫外區(qū)。激發(fā)在紫外區(qū)會損傷活體樣品并且引起細胞內(nèi)生物分子自發(fā)熒光的干擾。另外，用于檢測酸性器官內(nèi)的尤其是理想的pH探針幾乎沒有，這被認(rèn)為是細胞生物學(xué)及醫(yī)學(xué)發(fā)展的瓶頸。因此，我們研究的焦點在于設(shè)計具有好的選擇性、高的靈敏度、

4、好的光穩(wěn)定性以及工作pH在酸性范圍的近紅外pH熒光探針。 另外，在生物的氧化代謝過程中不斷產(chǎn)生各種活性氧自由基(ROS)，如超氧陰離子自由基(O2-)、羥基自由基(HO·)、過氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)、過氧亞硝基(0NOO-)等，這些自由基在生理學(xué)上起重要作用。在氧化脅迫下細胞內(nèi)氧化水平的快速升高能夠引起生物分子的損傷，導(dǎo)致各種疾病，比如癌癥、機體炎癥、組織過氧化、蛋白質(zhì)交聯(lián)變性、DNA損傷等。目前測定自由基的方法

5、主要有電子自旋共振法(ESR)或電子順磁共振法(EPR)、高效液相色譜法(HPLC)、化學(xué)發(fā)光法(CL)、熒光法以及電化學(xué)方法等。然而，由于生物體內(nèi)活性氧自由基的半衰期非常短，穩(wěn)態(tài)濃度極低，所以真正適用于檢測生物活體內(nèi)ROS的方法還是較少的。目前，熒光成像方法具有好的靈敏度、選擇性，并且充分利用了共聚焦激光掃描顯微鏡方法(CLSM)的優(yōu)點。CLSM是一種具有高分辨率的熒光顯微成像方法，它能夠給出探針?biāo)鶛z測自由基在細胞及組織的熒光成像。熒

6、光成像方法挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)的熒光方法，實現(xiàn)了自由基的“實時、可視、定量”檢測。目前迫切需要科研工作者開發(fā)對ROS能夠?qū)Ｒ蛔R別、快速響應(yīng)的熒光探針用以動態(tài)觀測研究某些器官中活性氧自由基的產(chǎn)生、代謝、相互轉(zhuǎn)化及其動態(tài)損傷生物機體的過程。本論文主要以提高探針的響應(yīng)速度、靈敏度以及選擇性為主要出發(fā)點，以熒光檢測和共聚焦顯微成像技術(shù)為研究手段，基于氫離子、超氧陰離子自由基分別引起探針熒光變化的機理，開展了兩方面的工作。 (一)以三碳花菁和3.

7、氨基苯酚為原料設(shè)計合成了一個雙重的近紅外pH熒光探針AP-Cy．AP-Cy具有高的靈敏度，好的光穩(wěn)定性，優(yōu)越的細胞膜穿透性以及強的pH依賴。pH滴定實驗表明酸性條件下在4.0-6.5 pH范圍熒光強度增強10倍有余，pKa為5.14.在堿性條件下，工作pH范圍是10.5-11.8,pKa為11.31.探針用于HepG2細胞的熒光成像結(jié)果進一步表明了該探針在監(jiān)測活體細胞內(nèi)H+潛在的重要價值。 (二)以熒光素和三苯基溴化鍺為原料，