喜馬拉雅塔爾羊異種克隆及相關(guān)研究.pdf

1、異種體細胞核移植研究對于瀕危野生動物保護，細胞內(nèi)核質(zhì)互作關(guān)系揭示以及醫(yī)學(xué)上“治療性克隆”具有重要意義。但是，種間核質(zhì)重構(gòu)胚胎附植前后發(fā)育潛能低，尤其是著床后的胚胎喪失是異種克隆基礎(chǔ)研究，甚至獲得異種克隆個體的瓶頸問題。本試驗對于此問題進行了探索，以去核山羊卵母細胞為胞質(zhì)受體，構(gòu)建喜馬拉雅塔爾羊異種重構(gòu)胚，研究了其附植前后的發(fā)育能力，并探討了山羊四倍體胚胎對于塔爾羊異種重構(gòu)胚胎胚外組織代償?shù)目赡苄浴?1、從上海動物園采集了雄性喜馬

2、拉雅塔爾羊耳部組織，常規(guī)組織培養(yǎng)法成功獲得塔爾羊耳成纖維細胞系，長期培養(yǎng)細胞仍具有良好的形態(tài)和正常的染色體核型(60，XY)。采用血清饑餓48h和細胞匯合24h處理細胞，可以顯著提高塔爾羊細胞G0/G1期比例。 2、把塔爾羊耳成纖維細胞移入去核奶山羊卵母細胞卵周隙，電融合法構(gòu)建異種間核質(zhì)重構(gòu)胚，激活后培養(yǎng)6.5天重構(gòu)胚胎發(fā)育至囊胚。山羊輸卵管內(nèi)活體培養(yǎng)的異種重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育率(16.67％)明顯高于體外培養(yǎng)組(4.66％)(P＜

3、0.01)。經(jīng)過血清饑餓48h，匯合24h兩種方法處理供核細胞所獲得的異種重構(gòu)胚的桑椹/囊胚發(fā)育率相似(27.27％VS28.21％，P＞0.05)。塔爾羊-奶山羊異種重構(gòu)胚的卵裂率與奶山羊-奶山羊重構(gòu)胚基本一致(86.64％VS85.19％)，但是其桑椹/囊胚發(fā)育率存在差異(30.36％VS44.44％，P＜0.05)。 3、塔爾羊異種重構(gòu)胚的Y染色體核型分析以及SRY基因擴增，鑒定基因組的遺傳物質(zhì)來自雄性塔爾羊細胞。通過位點

4、特異巢式PCR分析異種重構(gòu)胚的線粒體組成，結(jié)果表明在囊胚階段重構(gòu)胚線粒體以奶山羊線粒體為主，塔爾羊線粒體少量存在，所占比例＜0.1％。 4、將55枚塔爾羊異種重構(gòu)囊胚移至17只奶山羊受體子宮內(nèi)，胚齡30天B超檢測到3個孕囊存在，妊娠率為17.65％，但是胚齡45天再次檢測時已經(jīng)無孕囊存在。剖檢受體子宮發(fā)現(xiàn)塔爾羊異種重構(gòu)胚在奶山羊子宮內(nèi)終止妊娠時間大約在胚齡35天左右。 5、優(yōu)化電融合參數(shù)后，以DC0.8Kv/cm，40u

5、s，3次刺激山羊2-細胞期胚胎可以獲得高的融合率(80.08％)和四倍體胚胎發(fā)育率。山羊輸卵管內(nèi)活體培養(yǎng)，四倍體胚胎的囊胚發(fā)育率明顯高于體外培養(yǎng)組(45.16％VS3.33％.P＜0.01)。細胞組織學(xué)分析，83.3％的融合后發(fā)育的囊胚具有四倍體核型(4N=120)，但是其細胞數(shù)目僅為(53.3±2.8)，約為山羊二倍體囊胚的一半(116.0±4.9)。山羊四倍體囊胚移植到山羊受體子宮內(nèi)可以正常著床，其胚胎發(fā)育異常，但是胎膜部分發(fā)育正常

6、。 6、在含有180ng/mlPHA的mKSOM培養(yǎng)液中，通過玻璃針擠壓法將去除透明帶的8-細胞期塔爾羊異種重構(gòu)胚和4-細胞期山羊四倍體胚胎聚合，微孔內(nèi)培養(yǎng)24h后聚合成“單胚胎”，3.5天后發(fā)育至囊胚。通過囊胚透射電鏡分析塔爾羊異種重構(gòu)胚胎細胞與山羊四倍體胚胎細胞在聚合囊胚中，并不混雜，四倍體細胞主要分布在囊胚的滋養(yǎng)層部分，而異種重構(gòu)胚胎細胞則在內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層都由分布，并且初步判定2N-4N細胞間存在間隙樣細胞連接。塔爾羊異