產(chǎn)河豚毒素微生物的研究.pdf

1、河豚毒素是一類(lèi)重要的海洋生物毒素，其存在于河豚、蠑螈、斑足蟾等動(dòng)物和海底沉積物中。無(wú)色棱柱狀晶體，對(duì)熱不穩(wěn)定。難溶于水，可溶于弱酸的水溶液。在堿性溶液中易分解，在低的pH值溶液中也不穩(wěn)定。 雖然河豚毒素毒性強(qiáng)，但隨著科學(xué)的進(jìn)步，河豚毒素在治療人類(lèi)疾病方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。河豚毒素可以治療癌癥、止痛、止喘、鎮(zhèn)痙、止癢、治療哮喘、百日咳。河豚毒素在醫(yī)學(xué)上的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致河豚毒素的需求量逐步增加。但是，由于河豚毒素提取的原材料來(lái)

2、源于野生河豚，人工養(yǎng)殖的河豚魚(yú)幾乎不含TTX或含量極低，原料來(lái)源不足，限制了河豚毒素在臨床的使用。研究顯示，多種河豚魚(yú)和海洋動(dòng)物體內(nèi)的一些細(xì)菌和放線(xiàn)菌等微生物可以產(chǎn)生河豚毒素，因此，通過(guò)分離篩選產(chǎn)河豚毒素的海洋微生物，再經(jīng)過(guò)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)河豚毒素，可以解決原料來(lái)源不足，產(chǎn)量低的問(wèn)題，來(lái)滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，具有較大的經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益。本研究主要通過(guò)分離、篩選產(chǎn)河豚毒素的微生物，并對(duì)產(chǎn)河豚毒素的微生物進(jìn)行初步研究，以期待提取微生物源的河豚毒素

3、來(lái)滿(mǎn)足市場(chǎng)對(duì)河豚毒素的需求，進(jìn)一步證實(shí)河豚毒素是由微生物產(chǎn)生。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 一、河豚毒素產(chǎn)生菌的篩選 本文以野生河豚魚(yú)為研究對(duì)象，通過(guò)小鼠生物法對(duì)產(chǎn)河豚毒素微生物進(jìn)行了分離篩選。從河豚魚(yú)的卵巢中分離出35株野生菌，分離純化的野生菌傳代三次后得到15株性狀穩(wěn)定的菌株。用小鼠生物法對(duì)15株菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行初步檢測(cè)，其中11株菌株的發(fā)酵產(chǎn)物可以致小鼠死亡，繼而對(duì)11株菌株進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果有6株菌株致死小鼠時(shí)間不到10mi

4、n。根據(jù)小鼠死亡時(shí)間倒數(shù)-單位體重毒素劑量關(guān)系，計(jì)算菌株所含毒量，其中這6株菌株的毒素含量均在400ng/mI以上，分別是474.04ng/ml(B-301菌株)、420.91 ng/ml(B-304菌株)、425.0.ng/ml(B-307菌株)、482.31 ng/ml(B-320菌株)、489.40 ng/ml(B-333菌株)、425.0.ng/ml(B-335菌株)，其中B-333菌株的毒素含量最高。因此，選擇菌株B-333作

5、為出發(fā)菌株，并命名為ZY-23。 二、產(chǎn)毒菌株ZY-23的形態(tài)學(xué)及生理生化性狀研究 微生物的生理生化特征、生長(zhǎng)pH值及溫度范圍，可以為探索微生物發(fā)酵培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基組成提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本文根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，對(duì)出發(fā)菌株的菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)等進(jìn)行了觀(guān)察，并進(jìn)行了溫度、pH、Nacl耐受等實(shí)驗(yàn)和糖發(fā)酵、鹽利用等生理生化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果初步鑒定菌株ZY-23為沙雷氏菌屬的一個(gè)種。該菌株菌落較小，呈圓形，直徑0.5-1cm；白色

6、，表面濕潤(rùn)、光滑；菌落突起不明顯，邊緣光滑。菌體呈短桿狀、革蘭氏陰性、無(wú)芽孢、無(wú)莢膜、有鞭毛。能利用的糖類(lèi)為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇、肌醇、D-山梨醇，不能分解乳糖?？梢苑纸饷髂z，不能分解淀粉。可以還原檸檬酸鹽、丙酸鹽，硝酸鹽；接觸酶反應(yīng)、V-P反應(yīng)陽(yáng)性、氧化酶反應(yīng)、硫化氫試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)陰性。最適生長(zhǎng)溫度為26℃，最適pH為7.0，最適Nacl濃度為2％。 三、產(chǎn)毒菌株ZY-23的16SrRNA基因序列分析

7、 提取ZY-23菌株的基因組DNA，利用細(xì)菌的通用引物進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增成功后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR檢測(cè)，陽(yáng)性克隆送交上海生工進(jìn)行測(cè)序，將序列進(jìn)行比對(duì)，利用生物軟件構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，ZY-23菌株與Serratia sp.Tp5具有緊密的親緣關(guān)系，同源性達(dá)到99％。 四、ZY-23菌株發(fā)酵產(chǎn)物的分離提取 采用小鼠生物檢測(cè)法分別對(duì)ZY-23菌株的發(fā)

8、酵離心液和破壁后的菌體細(xì)胞上清液進(jìn)行毒素檢測(cè)，初步證實(shí)發(fā)酵離心液中含有毒性成分而破壁后的菌體上清液不含毒性成分，ZY-23發(fā)酵產(chǎn)生的毒性成分為分泌型的胞外產(chǎn)物。為了提取發(fā)酵離心液中的毒性成分，將發(fā)酵離心液經(jīng)過(guò)D101大孔吸附樹(shù)脂、D-152離子交換樹(shù)脂處理后，用醋酸水溶液洗脫，將洗脫液用小鼠生物檢測(cè)法檢測(cè)，結(jié)果表明，當(dāng)洗脫液pH6.5、6.0時(shí)，所注射小鼠出現(xiàn)明顯的中毒癥狀及死亡，pH 7.0以上的洗脫液注射小鼠，小鼠沒(méi)有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

9、收集pH 6.5、6.0的洗脫液，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。在pH 6.5、6.0的洗脫液加入等體積的4mol/lNaOH沸水浴45min，迅速冷卻到室溫，在激發(fā)波長(zhǎng)370nm，發(fā)射波長(zhǎng)495nm處檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)品與菌株ZY-23提取物在423nm都出現(xiàn)一明顯的發(fā)射峰，初步證實(shí)發(fā)酵產(chǎn)物中含有河豚毒素。 五、高效液相檢測(cè)菌株ZY-23的發(fā)酵產(chǎn)物 高效液相色譜法是檢測(cè)河豚毒素的一種重要的檢測(cè)方法。本文研究了高效液相色譜法測(cè)定河

10、豚毒素的條件，探討了色譜柱的種類(lèi)、流動(dòng)相的種類(lèi)、柱溫、流速等對(duì)色譜分離效果的影響。結(jié)果表明：用zorbax sb-aq柱測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間比Hypersil ODS反相柱長(zhǎng)。在191nm處，標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積最大，190nm處峰面積次之，峰面積隨波長(zhǎng)的增大呈下降趨勢(shì)。采用0.15％醋酸、0.15％醋酸：甲醇=95:5、乙腈：水=15:85、磷酸鈉緩沖液(Ph6.8)等作為流動(dòng)相測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品溶液，結(jié)果表明乙腈：水=15:85做流動(dòng)相時(shí)，基線(xiàn)平

11、穩(wěn)，峰形堆成，雜峰較少，物質(zhì)之間的分離度較大。采用不同的柱溫，TTX的出峰面積不同。當(dāng)柱溫為2 3℃時(shí)，TTX的出峰面積最大。隨著流速的增大，保留時(shí)間呈下降趨勢(shì)。當(dāng)流速為0.5ml/min，保留時(shí)間較長(zhǎng)，峰面積較大。 因此，確定了在本實(shí)驗(yàn)室條件下測(cè)定河豚毒素的高效液相色譜檢測(cè)方法：流動(dòng)相為乙腈：水15:85，流速為0.5ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)191nm，柱溫23℃，進(jìn)樣量：20ul。在最佳色譜條件下，檢測(cè)了ZY-23菌株的發(fā)酵產(chǎn)