光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914結(jié)構(gòu)對抗凍活性的影響.pdf

1、本研究采用實(shí)驗(yàn)室前期獲得的新疆荒漠甲蟲光滑鱉甲Anatolica polita抗凍蛋白基因ApAFP914，構(gòu)建不同的原核表達(dá)質(zhì)粒，獲得了具有不同標(biāo)簽的重組光滑鱉甲抗凍蛋白 ApAFPs。以 ApAFP914作為藍(lán)本，通過定點(diǎn)突變技術(shù)獲得了ApAFP914-A19T、ApAFP914-T33F和ApAFP914-T33&45F三個(gè)突變體基因。經(jīng)ExPAsy的Swiss Model生物信息學(xué)軟件預(yù)測野生型與突變體蛋白的高級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明帶

2、有突變位點(diǎn)的基因在空間結(jié)構(gòu)上變化并不大，位點(diǎn)的改變并沒有影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
　　將構(gòu)建好的pET32a-ApAFP914及其突變體在E. coliBL21(DE3)菌株中高效表達(dá)可溶性的融合蛋白TrxA-ApAFP914，Ni-NTA親和層析純化后純度達(dá)到95％以上，SDS-PAGE檢測其分子量約為30 kDa，Western Blot檢測具有活性。
　　采用差示掃描量熱儀（DSC）分析重組ApAFP914及其突變體的量熱學(xué)

3、特性并對其熱滯活性（THA）進(jìn)行了測定。ApAFP914s的THA測定值與溶液中冰核含量有關(guān)。當(dāng)ApAFP914s溶液冰核含量小于25%時(shí)，能夠觀察到明顯的重結(jié)晶延滯現(xiàn)象，即當(dāng)溫度降到熔點(diǎn)溫度以下溶液才開始結(jié)冰，表明ApAFP914s具有熱滯效應(yīng)。當(dāng)溶液冰核含量小于5%時(shí)，ApAFP914的THA可達(dá)到0.49℃，而ApAFP914-A19T則高達(dá)0.55℃，ApAFP914-T33F降低為0.38℃，ApAFP914-T33&45F的

4、0.31℃則更低。ApAFP914s的THA隨蛋白濃度的增加而變大，具有明顯的濃度效應(yīng)。通過比較熱滯活性（THA）3種突變體和ApAFP914，順序是ApAFP914-A19T> ApAFP914> ApAFP914-T33F＞ApAFP914-T33&45F。
　　ApAFPs對菌體的體外低溫保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ApAFP914可明顯提高大腸桿菌和酵母菌在低溫下的存活率，且具有明顯的時(shí)間效應(yīng)和濃度效應(yīng)。相同摩爾濃度下， ApAFP

5、914及其突變體對菌體的保護(hù)效果順序是 ApAFP914-A19T≈ApAFP914> ApAFP914-T33F≈ApAFP914-T33&45F。
　　ApAFP914也可顯著降低4℃、-4℃或-7℃低溫條件下紅細(xì)胞的溶血率。初步推測ApAFP914通過與冰核吸附結(jié)合阻止冰晶的生長，同時(shí)與紅細(xì)胞膜結(jié)合保護(hù)膜完整性而發(fā)揮低溫保護(hù)作用。
　　用DSC法測定了鹽溶液NaCl、LiCl、CaCl2、MgCl2及多羥基醇類物質(zhì)山梨

6、醇、海藻糖對重組光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914熱滯活性的影響。發(fā)現(xiàn)鹽離子可明顯依數(shù)性地增加重組ApAFP914的熱滯活性，且二價(jià)鹽離子溶液的增效作用大于一價(jià)鹽離子，在低濃度條件下尤為明顯。兩種多羥基物質(zhì)的增效作用小于鹽離子作用，需在高濃度下才表現(xiàn)出明顯的增效作用。
　　本研究還探究了 ApAFP914作為外源添加劑對小鼠卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的影響。通過形態(tài)觀察及FDA、PI雙染色技術(shù)統(tǒng)計(jì)添加ApAFP914后小鼠卵母細(xì)胞玻璃化冷凍