康婦炎膠囊對衣原體感染后TLRs介導(dǎo)的生殖道炎癥的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　近年來，隨著性傳播疾病發(fā)病率的增高，生殖道感染的發(fā)病率居高不下，直接危害著人類的生殖健康;沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，CT)是常見的導(dǎo)致生殖道感染的病原微生物，機(jī)體的自身免疫機(jī)能在感染和抗感染過程中起著重要的作用。越來越多的研究證實(shí)，中性粒細(xì)胞（Polymorph nuclear leukocytes，PMN）為主要效應(yīng)細(xì)胞的天然免疫應(yīng)答在預(yù)防對抗CT感染方面起著重要的作用。其中TLRs信號

2、通路在介導(dǎo)中性粒細(xì)胞在感染局部募集、激活及反應(yīng)模式中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。然而作為炎癥反應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞的中性粒細(xì)胞在發(fā)動免疫反應(yīng)抗病原體感染的同時，也伴有對健康組織細(xì)胞造成炎癥性損害的風(fēng)險?？股氐目垢腥局委熓钱?dāng)前衣原體性生殖道炎癥的主要藥物治療方案;但該治療方案在很大程度上并不能徹底消除CT感染后對輸卵管等生殖道組織的破壞。康婦炎膠囊則是中藥婦科清熱劑的代表性藥物，近年來多項(xiàng)臨床研究肯定了康婦炎膠囊對輸卵管炎等盆腔炎性疾病的治療效果。然而

3、，迄今為止，有關(guān)康婦炎膠囊的抗盆腔炎性疾病的研究主要集中在臨床觀察、經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，罕見其作用機(jī)制研究報道，更缺乏該藥對TLRs介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的研究。
　　本研究以衣原體性生殖道感染小鼠為模型，觀察康婦炎膠囊對生殖道炎癥及生育力的改善作用，研究康婦炎膠囊在CT感染后生殖道炎癥中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，以期揭示該藥的治療機(jī)制。
　　目的：
　　本研究以衣原體性生殖道感染小鼠為模型，觀察康婦炎膠囊對生殖道炎癥及生育力的改善

4、作用，研究康婦炎膠囊在CT感染后生殖道炎癥中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法：
　　1.170只雌性ICR小鼠隨機(jī)分成2組：空白對照組（10只）、衣原體性生殖道感染小鼠模型對照組（160只）。將模型小鼠再隨機(jī)分成5組，即：模型對照組（30只）、康婦炎低劑量組（30只）、康婦炎中劑量組（30只）、康婦炎高劑量組（30只）、阿奇霉素組（30只）?？祴D炎低、中、高劑量組小鼠分別灌胃給予0.154g/kg，0.468g/kg，1.404g

5、/kg劑量的康婦炎，給藥體積為10ml/kg，每天1次，連續(xù)5周。阿奇霉素組小鼠灌胃給予0.13g/kg的阿奇霉素，給藥體積為10ml/kg，1次。正常組及模型組小鼠灌胃給予等體積雙蒸水。各組分別于給藥后1周、3周、5周，隨機(jī)選取10只小鼠摘眼球取血抗凝，解剖觀察生殖道的形態(tài)改變、HE染色觀察炎性細(xì)胞的浸潤、免疫組化檢測子宮組織中Cd11b的表達(dá)、ELISA檢測子宮髓過氧化物酶(MPO)的含量以及小鼠生殖能力檢測。
　　2.分離大

6、鼠的中性粒細(xì)胞，并體外培養(yǎng)于六孔板中，待細(xì)胞貼壁后給予一定劑量的衣原體感染（衣原體感染劑量為mio=2，感染時間為6h），和康婦炎藥物處理（康婦炎給藥濃度為10ng/10μg/1mg，用藥時間為6/12/24小時）。檢測經(jīng)康婦炎處理衣原體感染后的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生ROS、MPO的變化;康婦炎處理后培養(yǎng)液中衣原體濃度的變化以及TLR2/4激活和抑制劑對康婦炎膠囊調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的活性的影響，利用TLRs相關(guān)的受體激活劑和抑制劑分析康婦炎調(diào)節(jié)中性

7、粒細(xì)胞活性的相關(guān)分子機(jī)理。
　　結(jié)果：
　　1.動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　(1)生殖道病理解剖：衣原體感染模型組在感染5w后，可見小鼠陰道口紅腫，子宮有腫脹、積水等癥狀，HE染色可見炎癥細(xì)胞浸潤?？祴D炎給藥處理1w，3w和5w后，解剖觀察小鼠子宮腫脹、積水等癥狀明顯緩解，HE染色見小鼠子宮的炎癥細(xì)胞浸潤程度輕微改善。
　　(2)免疫組化檢測小鼠子宮Cd11b的表達(dá)：衣原體性生殖道感染小鼠子宮組織的CD11b表達(dá)水平顯著高

8、于空白組，且1w，3w和5w均有顯著差異（P＜0.05）。阿奇霉素組相比于模型組CD11b的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），康婦炎膠囊組相比于模型組均能一定程度降低CD11b的表達(dá)水平，其中5w后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(3)ELISA檢測子宮髓過氧化物酶(MPO)的含量：衣原體性生殖道感染模型組小鼠子宮組織的MPO表達(dá)水平顯著高于空白組，阿奇霉素組和康婦炎膠囊中濃度和高濃度組均低于模型組，其中高濃度康婦炎組相比

9、于模型組均具有顯著性差異（P＜0.05），低濃度康婦炎組無顯著性差異。
　　(4)小鼠生殖能力檢測：空白組小鼠生育時間最短，模型組生育時間顯示增加(P＜0.01)，康婦炎組相比于模型組生育時間有所降低，但沒有顯著性差異。模型組中的16只小鼠在觀察期限內(nèi)(9w)有兩只小鼠未受孕，不孕率達(dá)12.5％，康婦炎組的16只小鼠均受孕?？祴D炎組生仔數(shù)顯著高于模型組，具有顯著性差異(P＜0.05)。康婦炎組和模型組均有一組母鼠死亡，模型組另有4

10、只鼠仔死亡。
　　2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　(1)康婦炎膠囊抑制中性粒細(xì)胞ROS的產(chǎn)生：衣原體感染中性粒細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加(P＜0.001)，而康婦炎膠囊處理細(xì)胞后顯著抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，其中K-1mg的三個時間點(diǎn)以及K-10μg和10ng的12h和24h與衣原體組相比均有顯著性差異(P＜0.001)。
　　(2)康婦炎膠囊抑制中性粒細(xì)胞MPO的分泌：衣原體感染中性粒細(xì)胞后，MPO的分泌水平升高，但無顯著

11、性差異。在康婦炎膠囊處理細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)液中的MPO水平被抑制了，其中K-1mg的三個時間點(diǎn)以及K-10μg和10ng的12h和24h與衣原體組相比均有顯著性差異（P＜0.05）。
　　(3)康婦炎膠囊促進(jìn)中性粒細(xì)胞吞噬衣原體：康婦炎膠囊處理后，收取細(xì)胞培養(yǎng)液檢測衣原體載量，發(fā)現(xiàn)康婦炎膠囊顯著降低培養(yǎng)液中衣原體濃度（P＜0.01）。
　　(4)TLR2/4激活和抑制劑對康婦炎膠囊調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的活性的影響：康婦炎膠囊顯著降低

12、培養(yǎng)液中衣原體負(fù)荷量（P＜0.05）。而當(dāng)TLR2激動劑PGN（10μg·ml-1）和TLR4激動劑LPS(100ng·ml-1)分別作用6h后，衣原體負(fù)荷量相比于康婦炎組顯著下降（P＜0.01，P＜0.001）。相比之下，當(dāng)TLR2抗體和TLR4抗體(10μg·ml-1)分別作用6h后，衣原體負(fù)荷量與康婦炎組基本持平。對于MPO的分泌，TLR2/4激動劑作用后與康婦炎組無顯著性差異，而其抑制劑作用后卻相比于康婦炎組有所降低，其中TLR