多位點(diǎn)微透析采樣技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)大鼠體內(nèi)的三妙丸中生物堿含量的方法學(xué)研究.pdf

1、三妙丸(Sanmiao Wan,SMW)方最初記載于明代虞摶《醫(yī)學(xué)正傳》,是中醫(yī)臨床常用方,由黃柏、蒼術(shù)、牛膝組成,可補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨,主治濕熱下注之痹病,已被《中國(guó)藥典》收錄。方中黃柏為君藥,蒼術(shù)為臣藥,牛膝為佐使藥,其中,《本草經(jīng)疏》載:牛膝“走而能補(bǔ),性善下行”,可引蒼術(shù)、黃柏入下焦而祛濕熱。黃柏中有效成分主要為小檗堿、藥根堿、巴馬汀等生物堿。三妙丸臨床可用于治療關(guān)節(jié)炎,為研究三妙丸中有效成分的作用機(jī)制,我們首先對(duì)有效成分在組織內(nèi)的分

2、布進(jìn)行研究,而研究有效成分的分布涉及生物樣品的處理。傳統(tǒng)的生物樣品處理方法是組織勻漿,然后將樣品進(jìn)一步純化,再用較為靈敏的檢測(cè)手段進(jìn)行分析,這種處理樣品的方法繁瑣、費(fèi)時(shí),而且需要消耗大量的人力物力。微透析技術(shù)是根據(jù)物質(zhì)順濃度梯度擴(kuò)散和半透膜對(duì)小分子化合物具有通透性的原理設(shè)計(jì),將微透析采樣技術(shù)應(yīng)用于三妙丸有效成分的研究,生物樣品不需要前處理,可直接進(jìn)樣分析;多位點(diǎn)微透析采樣可同時(shí)在同一動(dòng)物血、肝臟、關(guān)節(jié)腔等不同部位插入探針,減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)

3、量,降低動(dòng)物個(gè)體差異引入的測(cè)量誤差;易于與高靈敏度的分析儀器聯(lián)用,可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體外源性和內(nèi)源性物質(zhì)濃度變化進(jìn)行實(shí)時(shí)、在線檢測(cè),特別適用于研究微透析組織樣品濃度的動(dòng)態(tài)變化。基于以上原因,本論文以三妙丸為研究對(duì)象,探討微透析探針回收率的影響因素,并利用多位點(diǎn)微透析技術(shù)與超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)聯(lián)用技術(shù),測(cè)定三妙丸中的小檗堿在大鼠血、肝臟、膝關(guān)節(jié)透析液中的濃度。具體研究工作如下:
　　第一部分黃柏生物堿膝關(guān)節(jié)和血

4、液在體微透析方法的建立
　　本研究采用反相高效液相色譜法(RP–HPLC)測(cè)定三妙丸中的黃柏生物堿的微透析探針的體內(nèi)外回收率的方法,分別考察了探針回收率影響因素及體內(nèi)回收率穩(wěn)定性,建立了黃柏生物堿膝關(guān)節(jié)和血液在體微透析的方法。采用增量法和減量法,用RP–HPLC法測(cè)定微透析樣品中藥根堿、巴馬汀、小檗堿的濃度,考察灌流液的流速及濃度對(duì)探針回收率的影響;探針?lè)謩e植入頸靜脈和膝關(guān)節(jié),考察生物堿在血和膝關(guān)節(jié)的體內(nèi)回收率穩(wěn)定性。結(jié)果顯示,藥

5、根堿、巴馬汀、小檗堿分離度均大于1.5,三種生物堿在0.04～1.0 mg/L內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.9998,n=7)色譜的專屬性、日內(nèi)和日間精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性等測(cè)定結(jié)果均符合微透析樣品的分析要求。增量法和減量法測(cè)得的回收率一致,在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的范圍內(nèi),探針回收率與流速成反比,與濃度無(wú)關(guān)。微透析的體內(nèi)回收率在5h內(nèi)能夠保持穩(wěn)定。說(shuō)明反透析法校正三妙丸中黃柏生物堿血和膝關(guān)節(jié)微透析的回收率時(shí),所用的微透析方法為下一步的測(cè)定三妙丸中黃柏

6、生物堿體內(nèi)濃度研究提供依據(jù)。
　　第二部分 UPLC–MS/MS法測(cè)定大鼠血、肝臟、膝關(guān)節(jié)透析液中的三妙丸中的小檗堿的濃度
　　三妙丸是中藥經(jīng)典方劑,為中醫(yī)臨床中的常用方。三妙丸中黃柏的主要有效成分為小檗堿,牛膝作為三妙丸中的佐使藥,有“引藥下行”之功。本研究基于建立的膝和血在體微透析可用于測(cè)定黃柏生物堿的體內(nèi)回收率,利用多位點(diǎn)微透析和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),測(cè)定三妙丸中的小檗堿在大鼠血、肝臟、膝關(guān)節(jié)的透析液中的濃

7、度。采用UPLC–ESI–MS/MS法,以0.1％甲酸(A相),乙腈(B相)梯度洗脫法,實(shí)現(xiàn)了快速測(cè)定微透析液中的小檗堿的超靈敏分析。小檗堿在枸櫞酸–枸櫞酸鹽葡萄糖溶液(Anticoagulant citrate dextrose,ACD)中的檢測(cè)限是0.015 ng/ml,日內(nèi)和日間精密度RSD小于8.0%,準(zhǔn)確度為–5.1～2.4%。采用微透析在體內(nèi)的連續(xù)采樣技術(shù),該法可與 UPLC–MS/MS聯(lián)用測(cè)定小檗堿在大鼠血、肝臟、膝關(guān)節(jié)的

8、濃度變化。不同類型的探針?lè)謩e插入大鼠頸靜脈、肝臟、膝關(guān)節(jié),以ACD為灌流液,分別以2.5、1.0、1.0μL/min的流速灌流。探針植入平衡1 h后,大鼠灌胃三妙丸水提物,劑量為17.5 g/kg BW生藥(蒼術(shù):黃柏:牛膝=3:2:2),收集微透析樣品,透析液每隔30 min收集一次。血探針對(duì)小檗堿的體內(nèi)平均回收率為47.8%;肝臟探針對(duì)小檗堿的體內(nèi)平均回收率為40.0%;膝關(guān)節(jié)探針對(duì)小檗堿的體內(nèi)平均回收率為32.5%。本研究利用UP