商陸腸道毒性及炮制解毒機(jī)理的研究.pdf

1、本學(xué)位論文的研究得到國家中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)——30種中藥飲片產(chǎn)地加工與炮制生產(chǎn)一體化關(guān)鍵技術(shù)規(guī)范研究(NO.201507002)的資助。
　　商陸是商陸科植物商陸（Phytolacca acinasa Roxb.）和垂序商陸(Phytolacca americanaL.)的干燥根。商陸性寒、味苦，有毒，具有逐水消腫，通利二便的功能，主治水腫脹滿，二便不通，用于水腫尿少，腹水脹滿等。商陸生品毒副作用較大，被歷代本草記載為有毒?，F(xiàn)代毒

2、性研究表明商陸對(duì)人體消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)都具有毒性，主要表現(xiàn)為惡心嘔吐、腹痛腹瀉并伴有眩暈頭痛、體溫升高、心跳加速、呼吸急促，嚴(yán)重者言語不清、躁動(dòng)抽搐，甚至昏迷和死亡。由于商陸毒性大，所以臨床使用前必須炮制，從漢代至今出現(xiàn)過炒、蒸、焙、浸及醋制等多種商陸的炮制方法，地方炮制規(guī)范記載商陸現(xiàn)多以“醋炙”和“醋煮”法炮制，2015年版中國藥典收載的炮制方法以“醋制”為主，商陸醋制后毒性降低，藥性緩和。
　　商陸臨床使

3、用不當(dāng)最常見的毒副作用是腹痛腹瀉，文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)人體每天約有7L水液通過腸道，腸道中的水通道蛋白(AQPs)是水液運(yùn)轉(zhuǎn)的重要蛋白，AQPs的調(diào)控異常導(dǎo)致水液運(yùn)轉(zhuǎn)障礙，表明機(jī)體腹瀉的產(chǎn)生與腸道水通道蛋白的變化密切相關(guān)。本論文作者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)商陸皂苷類成分能夠刺激巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，對(duì)家兔眼結(jié)膜具有強(qiáng)烈刺激性，顯示商陸具有黏膜及致炎刺激性，但其導(dǎo)致腹痛腹瀉的原因不明，為深入探索商陸導(dǎo)致機(jī)體腹瀉及腸黏膜刺激的毒性成分、解釋炮制解毒的

4、科學(xué)內(nèi)涵，本學(xué)位論文建立了小鼠整體動(dòng)物模型和體外HT-29細(xì)胞模型，以小鼠腸道水腫、腹瀉、結(jié)腸和HT-29細(xì)胞水通道蛋白(AQPs)表達(dá)為指標(biāo)，對(duì)商陸不同部位化學(xué)成分進(jìn)行毒性對(duì)比，分離得到商陸的主要毒性成分，對(duì)毒性成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。
　　1商陸毒性評(píng)價(jià)模型的建立
　　研究建立了小鼠整體腸道毒性模型，以小鼠腸道含水量為指標(biāo)，考察商陸對(duì)小鼠腸道水腫的影響。同時(shí)因腹瀉是商陸臨床主要的毒性表現(xiàn)之一，故以小鼠糞便形態(tài)及糞便含水量為指

5、標(biāo)，考察商陸對(duì)小鼠腹瀉的影響。另據(jù)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，腸道的水液運(yùn)轉(zhuǎn)與結(jié)腸內(nèi)的水通道蛋白(AQPs)有關(guān)。AQPs是腸腔水液運(yùn)轉(zhuǎn)的重要途徑，當(dāng)AQPs調(diào)控發(fā)生障礙，水液無法透過腸上皮細(xì)胞被吸收，大量水液滯留于腸腔，繼而導(dǎo)致腹瀉。本文以結(jié)腸及腸上皮細(xì)胞內(nèi)AQPs表達(dá)水平為指標(biāo)，結(jié)合整體小鼠腸道水腫和腹瀉情況，篩選商陸的毒性部位及毒性成分。
　　2商陸不同極性部位的毒性比較研究
　　采用石油醚、二氯甲烷、正丁醇三種不同極性的溶劑將商陸

6、70％乙醇提取物依次萃取，獲得商陸石油醚、二氯甲烷、正丁醇和水相4個(gè)極性部位，小鼠灌胃給藥（折合成生藥量高劑量組為13.5 g·kg-1，低劑量組為1.35 g·kg-1，以小鼠腸道水腫程度、腸道含水量、糞便含水量、腹瀉程度及結(jié)腸AQP1、AQP3和AQP4 mRNA表達(dá)為指標(biāo)，比較商陸不同極性部位的毒性。研究結(jié)果表明，商陸正丁醇部位能夠?qū)е滦∈竽c道明顯水腫、十二指腸和空腸含水量顯著升高，糞便含水量上升，小鼠結(jié)腸AQP1、AQP3和AQ

7、P4 mRNA表達(dá)顯著變化，而商陸其他極性部位未見有顯著性影響。由于結(jié)腸內(nèi)AQP1處于腸道血管內(nèi)皮細(xì)胞上，AQP1表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致腸道毛細(xì)血管吸收水液減少;AQP3相對(duì)于AQP4為結(jié)腸上皮細(xì)胞優(yōu)勢(shì)蛋白，當(dāng)AQP3下調(diào)時(shí)，結(jié)腸上皮細(xì)胞吸收水液亦減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明商陸導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生明顯腹瀉，其原因可能為腸道AQP1、AQP3低表達(dá)，引起腸腔水液吸收減少，從而導(dǎo)致腹瀉。上述結(jié)果表明商陸正丁醇部位為主要毒性部位，正丁醇提取物中含有商陸主要的致瀉毒

8、性成分。
　　3商陸正丁醇部位模擬酷制前后毒性變化研究
　　商陸正丁醇部位為商陸毒性成分的富集部位，商陸飲片醋制后毒性降低，為了考察商陸正丁醇部位醋制前后毒性的變化，本論文依據(jù)商陸飲片炮制工藝將商陸正丁醇部位進(jìn)行模擬醋制，采用小鼠整體模型，以小鼠腸道水腫程度、腸道含水量、糞便含水量、腹瀉程度及結(jié)腸AQP1、AQP3、AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)為指標(biāo)，比較商陸正丁醇部位模擬醋制前后毒性大小，結(jié)果顯示商陸醋制正丁醇部位小鼠腸道

9、水腫程度下降、十二指腸和空腸含水量下降、糞便含水量下降、小鼠腹瀉癥狀明顯好轉(zhuǎn)，與未炮制正丁醇組相比小鼠結(jié)腸AQP1、AQP3 mRNA和蛋白表達(dá)上升，AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)下降，AQP1、AQP3、AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)趨向正常水平，表明醋制能夠緩解商陸正丁醇部位的毒性。
　　4商陸正丁醇部位的分級(jí)分離及毒性比較研究
　　由于商陸正丁醇部位浸膏中所含皂苷及其他化合物極性跨度較大，為了進(jìn)一步縮小商陸毒性成分的范圍，

10、論文采用乙醚沉淀法，將商陸正丁醇部位分離為“經(jīng)乙醚沉淀后上清液”以及“沉淀”兩個(gè)部位，乙醚沉淀部位主要含有商陸大極性皂苷，而乙醚沉淀后上清液主要為小極性皂苷，進(jìn)一步采用小鼠腸道及腹瀉模型，研究商陸正丁醇部位經(jīng)乙醚沉淀后的沉淀物及乙醚沉淀后上清液對(duì)小鼠糞便含水量、小鼠腹瀉情況及結(jié)腸AQP1、AQP3、AQP4mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)乙醚沉淀后的上清液能夠?qū)е滦∈蠹S便含水量顯著升高，小鼠產(chǎn)生明顯腹瀉，小鼠結(jié)腸AQP1、AQP3 mR

11、NA顯著下調(diào)，AQP4 mRNA表達(dá)顯著升高，表明商陸經(jīng)乙醚沉淀后上清液為商陸正丁醇中的毒性部位，商陸正丁醇部位的毒性成分大部分轉(zhuǎn)移至“經(jīng)乙醚沉淀后上清液”（后稱“毒性部位”）之中，表明毒性成分可能為小極性的化合物，如小極性皂苷。
　　5商陸毒性成分的分離及鑒定
　　選擇適當(dāng)?shù)南疵搫┖惋@色劑，結(jié)合硅膠柱層析、C18反向柱層析和Sephadex LH-20柱層析，對(duì)商陸正丁醇部位經(jīng)乙醚沉淀后上清液進(jìn)行系統(tǒng)的分離純化，最后分離得

12、到6個(gè)化合物，采用LC-MS及核磁共振技術(shù)，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，分別為β-谷甾醇、商陸皂苷A(EsA)、商陸皂苷B(EsB)、商陸皂苷C(EsC)、商陸皂苷D(EsD)和商陸皂苷F(EsF)。
　　6商陸毒性成分的毒性比較研究
　　建立HT-29細(xì)胞模型，以HT-29細(xì)胞內(nèi)AQP3 mRNA和蛋白的表達(dá)為指標(biāo)，首先將商陸各化合物以1、3、5、10、20μg·mL-1為濃度梯度作用于HT-29細(xì)胞4.5 h，通過量-效實(shí)驗(yàn)確定各

13、化合物最佳給藥濃度為10μg·mL-1，將商陸各化合物在10μg·mL-1劑量下進(jìn)行HT-29細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，分別作用0、2、3、4、5、6h，通過時(shí)-效實(shí)驗(yàn)確定各化合物最佳給藥時(shí)間為5h，在此條件下比較EsA、EsB、EsC、EsD和EsF的毒性。研究結(jié)果表明，EsB和EsC能夠顯著降低HT-29細(xì)胞內(nèi)AQP3 mRNA和蛋白的表達(dá)，且EsC的毒性強(qiáng)于EsB，表明EsC及EsB是商陸的主要毒性成分。
　　將5種皂苷組合的混合物及毒性部

14、位作用于HT-29，發(fā)現(xiàn)在10μg·mL-1劑量下5種皂苷混合物和毒性部位均能顯著降低細(xì)胞內(nèi)AQP3的表達(dá)，且效果強(qiáng)于EsB和EsC，說明商陸皂苷之間可能存在協(xié)同作用，導(dǎo)致各商陸皂苷混合物毒性強(qiáng)于單一商陸皂苷化合物。
　　7醋制對(duì)商陸正丁醇部位皂苷類成分的影響
　　論文采用高效液相與質(zhì)譜聯(lián)用的方法研究商陸正丁醇部位醋制前后皂苷類成分變化，使用PeakviewTM軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析，得到精確的質(zhì)量、母離子和碎片離子，結(jié)合分

15、離得到的5個(gè)皂苷類化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，商陸正丁醇部位醋制后未見新化合物的生成，除商陸皂苷A(EsA)其余各皂苷類化合物峰面積均不同程度下降，商陸皂苷組成發(fā)生明顯變化，但未發(fā)現(xiàn)新成分。結(jié)合毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，商陸正丁醇部位醋制前后毒性的變化與正丁醇中有毒皂苷類化合物含量下降有關(guān)，同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)EsA為非有毒成分，2015版藥典將EsA作為藥材中含量測(cè)定指標(biāo)具有合理性。
　　8商陸生品、醋制品及毒性部位中EsC和EsB的含量測(cè)

16、定研究
　　商陸醋制后毒性下降，EsC和EsB為商陸中主要毒性成分，為研究醋制對(duì)商陸中毒性成分EsC和EsB的影響，論文采用HPLC-ELSD的方法檢測(cè)商陸生品、醋品及毒性部位中EsC和EsB的含量變化。結(jié)果顯示，商陸經(jīng)正丁醇萃取后EsC的含量從0.12％上升到2.05％，EsB從0.19％上升到2.28％，經(jīng)乙醚沉淀法沉淀后EsC和EsB的含量分別上升為2.59％和16.46％，表明正丁醇萃取法和乙醚沉淀法確實(shí)能夠有效富集商陸中

17、的毒性成分;商陸醋制后EsC和EsB的含量顯著下降，EsC的含量從0.12％下降為0.05％，EsB的含量從0.19％下降為0.10％，下降比例分別為58.3％和47.4％，表明商陸經(jīng)醋制確實(shí)能夠降低商陸的毒性，說明商陸醋制法具有科學(xué)性。
　　通過上述研究，本論文建立了商陸腸道毒性評(píng)價(jià)模型，研究了商陸腹瀉毒性作用，篩選、富集與腸道毒性相關(guān)的商陸皂苷類成分，發(fā)現(xiàn)不同皂苷類成分其毒性有較大的差異，EsA、EsD和EsF幾乎無毒性，而E

18、sC和EsB毒性較強(qiáng)，其中EsC毒性最強(qiáng)，且經(jīng)過系統(tǒng)毒性篩選、富集，EsB和EsC在毒性部位含量分別達(dá)到了2.59％和16.46％，故EsC和EsB是商陸引起腸道毒性的主要成分。商陸醋制后毒性下降，EsC和EsB含量下降，闡明了商陸醋制方法的科學(xué)有效;本論文進(jìn)一步研究引起機(jī)體腹瀉與導(dǎo)致腸道AQPs表達(dá)變化的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)商陸能夠?qū)е赂篂a小鼠結(jié)腸AQP1、AQP3和AQP4表達(dá)顯著變化，初步闡明了商陸腹瀉的毒性機(jī)制，為接下來商陸毒性機(jī)制研究