ORMDL3基因?qū)е聞用}粥樣硬化易感及機制研究.pdf

1、目的：
　　1、在中國漢族人群中運用遺傳關(guān)聯(lián)分析探討ORMDL3基因所在區(qū)域17q12內(nèi)兩個單核苷酸多態(tài)位點（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）與AS易感的關(guān)系;同時，探究AS病例與健康對照外周血單個核細(xì)胞(Peripheral BloodMononuclear Cell，PBMC) ORMDL3基因表達(dá)的差異;此外，探明上述SNP不同基因型與PBMC ORMDL3基因表達(dá)的關(guān)系。
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2、、探究氧化低密度脂蛋白(Oxidized Low-Density Lipoprotein，ox-LDL)能否調(diào)控ORMDL3基因表達(dá)并誘導(dǎo)EC自噬;在ox-LDL刺激下沉默ORMDL3基因的表達(dá)，以明確該基因在ox-LDL誘導(dǎo)的EC自噬中的作用及可能機制。另外嘗試驗證ORMDL3在EC基礎(chǔ)自噬和饑餓誘導(dǎo)自噬中的作用。
　　3、同上，在ox-LDL刺激EC并干擾ORMDL3基因表達(dá)的基礎(chǔ)上，探明該基因在ox-LDL誘導(dǎo)的EC凋亡和炎

3、癥中的角色。
　　方法：
　　1、在遺傳關(guān)聯(lián)分析中納入來自中國漢族人群的CAD病例和健康對照，收集樣本PBMC并提取DNA后，對兩個SNP位點rs7216389與rs9303277進(jìn)行基因分型并做統(tǒng)計處理，以確定基因型與CAD發(fā)病是否存在統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián);同時提取樣本PBMC總RNA和蛋白后，以實時定量及免疫印跡技術(shù)檢測ORMDL3基因mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況，分析CAD病例與對照之間基因表達(dá)是否有差異;另外在mRNA水平

4、上明確上述SNP位點不同基因型攜帶者之間基因表達(dá)是否有差異。
　　2、選取人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)和人主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human Aortic Endothelial Cell，HAEC)作為研究對象，以實時定量及免疫印跡檢測ORMDL3基因mRNA和蛋白表達(dá)情況，以免疫印跡檢測自噬標(biāo)志物MAPLC3B、SQSTM1/P62及BECN1蛋白水

5、平，以免疫熒光檢測LC3焦點形成。在ox-LDL刺激HUVEC和HAEC的基礎(chǔ)上，明確ox-LDL能否影響ORMDL3基因表達(dá)，并利用短發(fā)卡RNA(shRNA)沉默ORMDL3基因，以闡明ORMDL3在ox-LDL誘導(dǎo)的EC自噬中的作用。此外明確ORMDL3在EC基礎(chǔ)自噬和血清饑餓誘導(dǎo)的自噬中的作用。
　　3、選取HUVEC為研究對象，以免疫印跡檢測凋亡標(biāo)志物Cleaved Caspase3和Cleaved PARP蛋白水平，以流

6、式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞比例，以CCK-8試驗檢測細(xì)胞活性，以實時定量技術(shù)檢測炎癥因子TN、IL-6及IL-17A等炎癥因子mRNA表達(dá)水平。在ox-LDL刺激HUVEC和shRNA干擾ORMDL3表達(dá)的基礎(chǔ)上，探索ORMDL3在ox-LDL誘導(dǎo)EC凋亡和炎癥中的作用。
　　結(jié)果：
　　第一部分 ORMDL3基因與中國漢族人群動脈粥樣硬化易感的遺傳關(guān)聯(lián)分析
　　在本部分中，為研究中國漢族人群ORMDL3基因所在區(qū)域內(nèi)SNP

7、位點rs7216389和rs9303277與AS發(fā)病風(fēng)險是否存在關(guān)聯(lián)，在以病例-對照設(shè)計為核心的遺傳關(guān)聯(lián)分析中，我們共納入來自中國北方漢族人群和中國南方漢族人群的CAD病例1829例及健康對照1806例。在年齡及性別方面，CAD病例組及對照組未見差異。病例組身體質(zhì)量指數(shù)(Body Mass Index，BMI)、吸煙者比例、血甘油三酯、總膽固醇及LDL水平顯著高于對照組;病例組HDL水平顯著低于對照組。在上述兩個研究人群的病例和對照組中

8、，兩個SNP位點的分型結(jié)果未偏離哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）(P＞0.05)。
　　在中國北方漢族人群中，CAD病例組rs7216389 T等位基因與rs9303277 C等位基因頻率顯著高于對照組(rs7216389:71.77％ vs.67.07％; rs9303277:68.50％vs.64.66％)。在校正年齡、性別、BMI、血脂指標(biāo)及吸煙等因素之后，rs7216389與

9、rs9303277位點與CAD患病風(fēng)險顯著相關(guān)（rs7216389: P=0.003; rs9303277:P=0.017）。攜帶rs7216389 T等位基因或rs9303277 C等位基因的個體表現(xiàn)出更高的CAD患病風(fēng)險(rs7216389: odds ratio[OR]0.80，95％ confidence interval[CI]0.69-0.93; rs9303277: OR0.84,95％ CI0.73-0.97)。

10、　　之后，為探討上述ORMDL3基因SNP位點與基因表達(dá)的關(guān)系，首先我們提取89例患者的PBMC總RNA后以實時定量檢測ORMDL3基因mRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶上述兩個SNP風(fēng)險等位基因的個體ORMDL3基因mRNA表達(dá)水平顯著高于參考等位基因(Reference Allele)純合子攜帶者(rs7216389,P=0.012;rs9303277,P=0.004)。之后我們檢測并比較37例病例與37例對照PBMCORMDL3基因mRN

11、A水平，發(fā)現(xiàn)病例ORMDL3基因mRNA表達(dá)顯著高于對照(P=0.003);而以免疫印跡檢測4例病例與4例對照PBMC ORMDL3基因蛋白表達(dá)亦得出一致結(jié)論(P=0.034)。
　　第二部分 ORMDL3在動脈粥樣硬化中對內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控
　　以ox-LDL刺激HUVEC和HAEC，我們發(fā)現(xiàn)ox-LDL可以時間依賴(100μg/ml，處理0、4、8和12h)與劑量依賴(0、50和100μg/ml，處理12h)地上調(diào)ORM

12、DL3基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)。
　　之后我們研究了ox-LDL誘導(dǎo)EC自噬過程的細(xì)節(jié)，發(fā)現(xiàn)在HUVEC和HAEC中，ox-LDL可以時間依賴（100μg/ml，處理0、4、8和12h）與劑量依賴(0、50和100μg/ml，處理12h)地上調(diào)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B-Ⅱ蛋白表達(dá)水平;ox-LDL可以促進(jìn)SQSTM1/P62的累積;同時免疫熒光示ox-LDL刺激促進(jìn)HUVEC LC3焦點的形成;而ox-LDL與氯喹(50μM)共同刺

13、激HUVEC可進(jìn)一步加強LC3B-Ⅱ和SQSTM1/P62蛋白累積。上述結(jié)果證明了ox-LDL可促進(jìn)EC自噬過程。
　　為研究ORMDL3是否調(diào)控EC自噬，我們利用shRNA干擾HUVEC ORMDL3表達(dá)，結(jié)果證實基因干擾效率較高。干擾ORMDL3可以導(dǎo)致HUVEC細(xì)胞本底自噬水平降低;另外干擾ORMDL3可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的自噬強度。另外我們發(fā)現(xiàn)血清饑餓6h處理可引起HUVEC細(xì)胞較高的自噬水平，而干擾ORMDL3還可降低

14、血清饑餓(6h)誘導(dǎo)的自噬水平（即都表現(xiàn)為LC3B-Ⅱ轉(zhuǎn)化減少及SQSTM1/P62累積增多）。上述結(jié)果表明AS中，ORMDL3在異常脂質(zhì)代謝誘導(dǎo)的EC自噬中可能發(fā)揮重要作用;其也同樣可能與EC基礎(chǔ)自噬和饑餓誘導(dǎo)的自噬有關(guān)。
　　BECN1是重要的自噬正調(diào)控分子之一。我們發(fā)現(xiàn)干擾ORMDL3不僅可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的BECN1蛋白表達(dá)，還可下調(diào)細(xì)胞本底和饑餓誘導(dǎo)的BECN1蛋白表達(dá)，這說明ORMDL3可能通過BECN1調(diào)控自噬。

15、另外我們發(fā)現(xiàn)干擾ORMDL3并不能引起HUVECp-mTOR/ mTOR及p-AMPK/AMPK比值的變化。
　　綜上所述，在ox-LDL介導(dǎo)的EC自噬中，可能存在ox-LDL-ORMDL3-BECN1-自噬的調(diào)控方式;而ORMDL3可能在生理性或病理性自噬反應(yīng)中都發(fā)揮重要作用。
　　第三部分 ORMDL3在動脈粥樣硬化中對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和炎癥的影響
　　ox-LDL是一種強凋亡誘導(dǎo)劑，我們發(fā)現(xiàn)ox-LDL處理(100μ

16、g/ml，處理12h)可誘導(dǎo)HUVEC凋亡發(fā)生，表現(xiàn)為凋亡標(biāo)志物Cleaved PARP與Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)上調(diào)。而在基礎(chǔ)水平上，沉默ORMDL3后HUVEC Cleaved PARP與Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)同樣上調(diào)。之后我們發(fā)現(xiàn)與對照相比，干擾ORMDL3后HUVEC對ox-LDL的促凋亡毒性更為敏感，表現(xiàn)為Cleaved PARP與CleavedCaspase3蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，CCK-8試

17、驗示細(xì)胞活力進(jìn)一步減低，而流式細(xì)胞術(shù)示凋亡細(xì)胞比例明顯增多。
　　此外ox-LDL可有效促進(jìn)EC炎癥反應(yīng)，我們發(fā)現(xiàn)沉默ORMDL3可部分逆轉(zhuǎn)ox-LDL誘導(dǎo)的TNF和IL-17A mRNA表達(dá)，而IL-6表達(dá)未見改變。上述這些結(jié)果提示ORMDL3可能作為凋亡和炎癥調(diào)控因子參與AS發(fā)生發(fā)展。
　　結(jié)論：
　　1、ORMDL3基因所在17q12區(qū)域2個SNP位點rs7216389和rs9303277與中國漢族人群AS易感及

18、ORMDL3基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)。此外該基因在CAD患者中表達(dá)顯著高于對照。這些結(jié)果提示在中國漢族人群中ORMDL3基因可能是AS的一個易感基因。
　　2、ORMDL3不僅參與調(diào)控ox-LDL誘導(dǎo)的EC自噬，也在EC基礎(chǔ)自噬和饑餓誘導(dǎo)自噬中發(fā)揮作用。這說明ORMDL3可能是一個重要的自噬相關(guān)基因，其調(diào)控自噬的詳細(xì)機制目前尚不明確。
　　3、ORMDL3可能具有抗凋亡的功能，但是關(guān)于ORMDL3如何影響凋亡及其與自噬的關(guān)系仍存諸多疑