無脊椎動物家蠶為材料的肝毒性模型實驗動物替代研究.pdf

1、實驗動物替代方法，已廣泛應用于生命科學研究領域。家蠶是鱗翅目模式昆蟲，有著數(shù)千年畜牧化養(yǎng)殖歷史，且已積累了系統(tǒng)深入的生理學、病理學和毒理學資料。家蠶遺傳突變資源的創(chuàng)新及其在基礎生命體系、物質(zhì)代謝、能量代謝和遺傳方式上與哺乳類有眾多相似性的發(fā)現(xiàn)，使家蠶作為中國特色的模式昆蟲正逐漸向?qū)嶒瀯游锬Ｊ交l(fā)展。然而，如何通過系統(tǒng)地控制實驗用家蠶的遺傳因素和生長環(huán)境，實現(xiàn)家蠶“實驗動物化”，如何根據(jù)家蠶的生物學特性，優(yōu)選出替代方法研究類型，是家蠶在成

2、為標準的實驗動物過程中所必須突破的瓶頸。另外，家蠶與小鼠等經(jīng)典哺乳類模式動物相比，在外源化合物代謝動力學方面究竟存在哪些共性和差異，國內(nèi)外也尚無系統(tǒng)的研究。
　　本研究以家蠶實驗動物化的標準建設為目的，總結(jié)了家蠶實驗動物化的品種選育、飼養(yǎng)管理、設施管理等規(guī)范，設計了家蠶標準化飼養(yǎng)微屏障系統(tǒng)；通過肝毒性模式藥物對乙酰氨基酚（APAP）處理，系統(tǒng)地比較研究家蠶與哺乳動物體內(nèi)APAP的急性毒性分級和藥代動力學特性；通過代謝組學方法、高通

3、量分析（RNA-Seq）方法調(diào)查APAP對家蠶內(nèi)源性代謝物和基因表達的差異，揭示APAP在體內(nèi)所產(chǎn)生的生物效應；用試劑盒檢測APAP染毒后家蠶催化藥物代謝關鍵酶的活性，并通過生物信息學方法分析比較家蠶與小鼠等哺乳類在這些關鍵酶進化上的差異及活性位點差異。研究獲得的主要結(jié)果如下：
　　1.模藥APAP對家蠶的急性毒性分級、藥代動力學特征能夠為醫(yī)學實驗動物替代建立平行數(shù)據(jù)
　　急性毒性試驗結(jié)果顯示，APAP對家蠶毒性因品種不同而

4、表現(xiàn)出毒性敏感性不同，大造較皓月敏感。APAP處理雌、雄大造品種的LD50分別為2017±254μg/g和2169±300μg/g。急性毒性分級為中低級毒性，與哺乳類相似。
　　代謝動力學結(jié)果表明，低濃度600μg/g劑量和高濃度3600μg/g劑量APAP在家蠶體內(nèi)的藥動學呈一室開放型模型，消除半衰期（t1/2）分別為1.06h和2.77h；原藥達峰時間（tmax）分別為0.50h和1.00h；原藥達峰值濃度（Cmax）分別為6

5、7.69μg/ml和568.73μg/ml。相對生物利用度（AUC0-t）分別為：222.63 h?μg/ml和1976.32 h?μg/ml。代謝中間產(chǎn)物有N-乙酰對苯醌亞胺（NAPQI）產(chǎn)生，與哺乳類相比，藥物吸收分布、體內(nèi)代謝中間產(chǎn)物、總體的動力學(PK)相似，能為醫(yī)學實驗動物替代建立平行數(shù)據(jù)。
　　2.模藥APAP在家蠶的體內(nèi)能產(chǎn)生與哺乳類共同的生物效應
　　代謝組學分析顯示，以600μg/g劑量APAP經(jīng)口給藥家蠶

6、8 h后，循環(huán)血中差異代謝物在三羧酸循環(huán)、糖酵解途徑、氨基酸代謝、黑色素生成等途徑中，說明APAP在體內(nèi)所產(chǎn)生的毒性途徑主是因為藥物代謝過程中產(chǎn)生了氧化應激，影響了體內(nèi)能量供給、物質(zhì)轉(zhuǎn)運和信號傳導。代謝物差異分析發(fā)現(xiàn)，APAP誘導家蠶血淋巴中氨基酸代謝產(chǎn)生差異，推測氨基酸代謝的異常和蘋果酸、琥珀酸、延胡索酸等內(nèi)源代謝物的顯著下降相關，也與APAP染毒后產(chǎn)生的氧化應激相關。酪氨酸、多巴、海藻糖的顯著升高進一步證實過量的APAP導致了氧化應

7、激的產(chǎn)生；APAP誘導家蠶的膽固醇降低，卻使β-羥基β-甲基戊二酸升高，表明APAP導致家蠶的膽固醇合成途徑失衡，甾體激素的原料供給障礙影響機體的激素調(diào)節(jié)。
　　3.模藥APAP在家蠶的體內(nèi)能產(chǎn)生與哺乳類共同的藥理作用和毒性機理
　　RNA-Seq結(jié)果分析APAP給藥實驗組與對照組的差異基因表達顯示，在KEGG分析系統(tǒng)中與新陳代謝相關的通路里，大量的差異表達基因富集于三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、脂肪酸的氧化、糖酵解和糖異生等高產(chǎn)

8、能環(huán)節(jié)，從基因表達水平上進一步證明，APAP對家蠶機體的傷害，主要是氧化應激和能量代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、信號傳導等途徑異常所至，這與哺乳類所產(chǎn)生的肝損傷機理一致。
　　在KEGG分析系統(tǒng)中與有機體系統(tǒng)相關的通路里，大量的差異表達基因富集于心臟肌肉收縮、血管平滑肌收縮和調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架等循環(huán)系統(tǒng)的相關通路，以及部分神經(jīng)元突觸基因通路，這些與代謝組學結(jié)果一致。推測APAP對家蠶具有與哺乳類相一致的抑制花生四烯酸通路的藥理作用。
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9、.家蠶與小鼠的藥物代謝關鍵酶具有共同的活性位點和蛋白質(zhì)互作機制
　　生物信息分析結(jié)果顯示，家蠶和小鼠的谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶家族成員（GSTs）在結(jié)構(gòu)域和功能域方面，大多具有GSTs活性區(qū)域以及硫氧還蛋白的折疊模式；家蠶和小鼠的谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLc)蛋白都具有谷胱甘肽合成酶的功能域，谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCLM）都具有NADP依賴氧化還原酶功能域；家蠶硫氧還蛋白過氧化物酶家族（TPXs）中Jafrac1基因編碼的過氧化

10、物酶蛋白與小鼠的Prdx1和Prdx2基因編碼的過氧化物酶具有高度保守的結(jié)構(gòu)，家蠶的預測蛋白LOC733003、LOC101735759、LOC732921分別具有小鼠的Prdx3、Prdx4、Prdx5編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；家蠶的2個葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶成員（UGTs）和小鼠的21個UGTs成員具有共同的尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶保守功能域；家蠶和小鼠的細胞色素P450酶（CYP450）家族成員也具有CYP450

11、保守的結(jié)構(gòu)域和功能域。家蠶和小鼠的藥物代謝關鍵酶的結(jié)構(gòu)與功能域上的保守性，提示兩者在主要的解毒過程與作用機理中可能存在共同的特點。
　　5.家蠶中腸是可建立肝毒性模型的經(jīng)口給藥“首關效應”器官
　　根據(jù)APAP經(jīng)口經(jīng)藥家蠶組織中原藥APAP、中間產(chǎn)物NAPQI分布特點，催化藥物代謝反應的關鍵酶(GST、GCL、TPX、UGT、CYP450等)的活性變化結(jié)果可知，中間產(chǎn)物經(jīng)中腸后產(chǎn)量明顯提高，高劑量APAP可造成中腸的吸收功能

12、障礙。中腸組織中CYP450酶活變化顯著，中腸組織中GST、GCL、TPX、UGT酶活本底顯著高于脂肪體，且相應代謝酶活性變化較為顯著。表明在經(jīng)口給藥途徑中，家蠶中腸是藥物代謝的“首關效應”器官。在經(jīng)口給藥途徑中，家蠶的中腸與脂肪體相比而言，作為外源藥物的“首關效應”器官，類比哺乳類解毒器官（肝臟）更為準確。家蠶中腸是更合適的研究哺乳類肝毒性藥物毒性機理的靶器官（組織）模型。
　　6.結(jié)論
　　家蠶已具備實驗動物化的基本條件