基于膠原-Matigel的肺臟組織工程實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目前，慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘以及肺纖維化(PF)都已成為高死亡率的肺臟疾病。伴隨著氣候和環(huán)境的改變，人類現(xiàn)在面臨的肺臟疾病呈明顯增長(zhǎng)的趨勢(shì)。近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，隨著人們對(duì)于肺臟的基礎(chǔ)理論研究的不斷深入，以及針對(duì)一些肺臟疾病發(fā)病機(jī)理研究所取得的積極進(jìn)展，氧氣療法、手術(shù)治療和肺臟疾病康復(fù)療法等治療手段有了長(zhǎng)足進(jìn)步。盡管如此，肺臟移植仍是肺臟疾病晚期的主要治療手段。然而，由于缺少肺臟器官來(lái)源，目前很多患者根本無(wú)法得到有效治療。尋找新的

2、治療方法和手段業(yè)已成為肺臟疾病治療的當(dāng)務(wù)之急。組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展已為肺臟疾病的治療帶來(lái)新的希望。
　　 組織工程是融合了生命科學(xué)、材料科學(xué)以及工程科學(xué)的原理和方法，旨在再造人體組織器官的新興交叉學(xué)科。近年來(lái)，組織工程研究先后在皮膚、軟骨、神經(jīng)、血管及心肌組織再造中取得了突破性進(jìn)展，并有部分組織工程產(chǎn)品進(jìn)入臨床應(yīng)用。
　　 肺臟具有通氣和換氣功能，肺實(shí)質(zhì)為肺內(nèi)支氣管的各級(jí)分支和其末端的肺泡。近年來(lái)肺臟組織工程研究進(jìn)展迅

3、速，先后有研究人員成功在體外再造了組織工程化肺泡和支氣管粘膜。盡管如此，針對(duì)肺臟體外再造，仍存在如何優(yōu)選細(xì)胞支架材料，如何優(yōu)化細(xì)胞-支架復(fù)合體體外培育環(huán)境以及進(jìn)一步提高再造肺臟組織質(zhì)量等一系列問(wèn)題。
　　 本論文采用組織工程技術(shù)開(kāi)展了肺泡和支氣管粘膜體外再造研究。其中，在肺泡體外再造方面，以小鼠胚胎期肺臟細(xì)胞(FPCs)為種子細(xì)胞，利用膠原/Matrigel為細(xì)胞提供三維立體生長(zhǎng)環(huán)境，并針對(duì)目前國(guó)際上尚無(wú)有效手段控制體外再造肺泡

4、結(jié)構(gòu)現(xiàn)狀，首次應(yīng)用海藻酸鈉(APA)微囊發(fā)揮空間占位作用，通過(guò)APA微囊控制肺泡樣結(jié)構(gòu)的形成，成功在體外再造了肺泡樣結(jié)構(gòu)，取得了預(yù)期結(jié)果。在支氣管粘膜體外再造方面，以膠原/Matrigel為胚胎期肺臟成纖維細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞支架，成功在體外再造了支氣管粘膜樣結(jié)構(gòu)，并研究了Matrigel對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞再生的影響。目前，針對(duì)Matrigel對(duì)支氣管上皮細(xì)胞再生的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本論文基于肺臟體外再造所需支架(APA微

5、囊)以及肺臟再造不同結(jié)構(gòu)(肺泡及支氣管粘膜樣結(jié)構(gòu))，主要研究?jī)?nèi)容共分三個(gè)部分，概括介紹如下：
　　 第一部分：制備海藻酸鈉(APA)微囊及其物理與生物學(xué)性能的評(píng)價(jià)
　　 微囊是一種可以形成免疫隔離屏障的半透膜結(jié)構(gòu)，它的物理和生物學(xué)特性通過(guò)控制制備過(guò)程中的物理參數(shù)可以加以調(diào)控。本研究的目的是，在已有的研究基礎(chǔ)上，制備出適合用于肺泡樣結(jié)構(gòu)再造中保持肺泡大小與形狀的APA微囊，并對(duì)其物理和生物學(xué)特性進(jìn)行評(píng)估。我們?cè)谝延械难芯炕?/p>

6、礎(chǔ)上，選定以下參數(shù)制備微囊：靜電場(chǎng)為6kV/1.5cm，泵推進(jìn)速度為15mL/h，針頭內(nèi)徑為0.09mm，海藻酸鈉濃度為2％，多聚賴氨酸濃度為0.05％，作用時(shí)間為6min，制備粒徑為200-300μm。人的肺泡平均直徑在250μm左右。因此在這些參數(shù)控制下，制備的微囊更適宜用于肺泡樣結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。
　　 在物理性能評(píng)價(jià)方面，研究結(jié)果表明，APA微囊具有較好的機(jī)械強(qiáng)度；制備的APA微囊可以使4kD的小分子物質(zhì)自由擴(kuò)散進(jìn)微囊內(nèi)，70

7、kD的中等分子物質(zhì)可部分通過(guò)，而150kD的大分子物質(zhì)不能或大部分不能通過(guò)微囊膜。在生物學(xué)性能方面，觀察APA微囊腹腔移植后的形態(tài)表明，其具有較好的生物相容性。
　　 在本部分研究中，研制了APA微囊，掌握了APA微囊研制的關(guān)鍵技術(shù)，摸索了微囊研制的系列條件，并對(duì)其物理和生物學(xué)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)，研制的APA微囊大小適用于肺泡樣結(jié)構(gòu)構(gòu)建研究，并且具有良好生物相容性。
　　 第二部分：以膠原/Matrigel-海藻酸鈉

8、微囊為支架材料體外構(gòu)建組織工程化肺泡樣結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)研究
　　 對(duì)于遠(yuǎn)端肺臟組織的構(gòu)建，肺泡樣結(jié)構(gòu)的實(shí)現(xiàn)至關(guān)重要。本研究的目的是以FPCs為種子細(xì)胞，采用膠原/Matrigel為細(xì)胞提供三維生長(zhǎng)環(huán)境，采用APA微囊這種材料來(lái)發(fā)揮空間占位作用，進(jìn)而通過(guò)改變制備過(guò)程的物理參數(shù)來(lái)控制肺泡大小和形狀，從而更好地實(shí)現(xiàn)組織工程化結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。
　　 大體觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PCs與膠原/Matrigel-APA微囊復(fù)合可以形成組織片層，隨著培養(yǎng)時(shí)

9、間的延長(zhǎng)，片層逐漸收縮；培養(yǎng)14d后觀察發(fā)現(xiàn)片層收縮更加明顯，繼續(xù)培養(yǎng)至21d，最終形成蝴蝶狀外觀。倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)在三維支架材料中FPCs在微囊周圍生長(zhǎng)，APA微囊保持良好的完整性。H.E.染色結(jié)果顯示，體外構(gòu)建7d和14d的組織片層中的囊泡樣結(jié)構(gòu)和小鼠正常肺臟的組織結(jié)構(gòu)很相似。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色可以看出，在體外培養(yǎng)7d和14d的肺臟組織片層中，均有廣譜細(xì)胞角蛋白(pan-CK)，波形蛋白(Vimentin)和細(xì)胞表面活性物質(zhì)

10、C(SpC)陽(yáng)性表達(dá)。通過(guò)透射電子顯微鏡觀察體外培養(yǎng)7d和14d的組織片層可以觀察到板層小體，表明Ⅱ型肺泡細(xì)胞在囊泡狀空間結(jié)構(gòu)的環(huán)境下能夠保持未分化狀態(tài)。掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)肺臟組織片層縱剖面有球形中空的囊狀結(jié)構(gòu)。
　　 本部分研究，成功在體外構(gòu)建了肺泡樣結(jié)構(gòu)，使微囊發(fā)揮空間占位作用，并能夠保持Ⅱ型肺泡細(xì)胞的未分化狀態(tài)。
　　 第三部分：以膠原/Matrigel為支架材料體外構(gòu)建組織工程化支氣管粘膜的實(shí)驗(yàn)研究
　

11、　 支氣管粘膜在肺臟導(dǎo)氣部發(fā)揮著重要的作用。我們采用支氣管上皮細(xì)胞(Beas-2B)和胚胎期肺臟成纖維細(xì)胞(MRC-5)為種子細(xì)胞，以膠原/Matrigel為支架材料，應(yīng)用氣液界面培養(yǎng)的方法體外構(gòu)建支氣管粘膜。其中，上皮細(xì)胞的接種位于成纖維細(xì)胞與膠原/Matrigel混合并凝膠化之后。在研究中，還通過(guò)是否在接種上皮細(xì)胞之前添加Matrigel的方式，來(lái)探討了Matrigel對(duì)上皮細(xì)胞再生的影響。
　　 倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)構(gòu)

12、建的支氣管粘膜表面有支氣管上皮細(xì)胞的聚集、融合，其下層成纖維細(xì)胞在膠原/Matrigel支架材料中，可以相互連接并形成網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)。H.E.染色結(jié)果表明，在成纖維細(xì)胞和膠原/Matrigel復(fù)合后，如果添加Matrigel后再接種上皮細(xì)胞層，可以形成表面完整的上皮細(xì)胞層。相反，沒(méi)有添加Matrigel的支氣管粘膜上皮細(xì)胞層不完整。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，添加Matrigel的支氣管粘膜pan-CK陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞較多，說(shuō)明Matrigel可

13、以促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)；沒(méi)有添加Matrigel的支氣管粘膜pan-CK陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞較少。添加Matrigel對(duì)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)基本沒(méi)有影響。掃描電子顯微鏡觀察體外構(gòu)建的支氣管粘膜，發(fā)現(xiàn)添加Matrigel后，有纖毛樣結(jié)構(gòu)的形成，說(shuō)明Matrigel可以促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞的進(jìn)一步分化。
　　 本部分研究，在體外成功構(gòu)建了支氣管粘膜，并證實(shí)Matrigel可以促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞的再生。
　　 綜上所述，本研究中，在支架研制方

14、面，掌握了APA微囊研制的關(guān)鍵技術(shù)，摸索了微囊研制的系列條件，成功制備了適用于肺泡樣結(jié)構(gòu)構(gòu)建的APA微囊，且具有良好的物理性能和生物相容性。在肺泡構(gòu)建方面，以FPCs為種子細(xì)胞，膠原/Matrigel為支架材料，充分發(fā)揮APA微囊的空間占位作用，在體外構(gòu)建了肺泡樣結(jié)構(gòu)，其中，通過(guò)調(diào)節(jié)微囊的大小和形狀可以有效控制再造肺泡樣結(jié)構(gòu)中肺泡的大小和形狀，實(shí)現(xiàn)了對(duì)肺泡樣結(jié)構(gòu)的初步控制。在支氣管粘膜構(gòu)建方面，以Beas-2B和MRC-5為種子細(xì)胞，膠