改性膠原支架組織工程化脊髓修復成年鼠脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、背景：脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)后的神經(jīng)再生一直是生物醫(yī)學界研究的一個重要課題。近年來的基礎研究表明脊髓損傷后仍存在一定再生能力，一些實驗結果令人鼓舞，然而成年哺乳動物脊髓損傷后的修復仍十分困難。組織工程為脊髓損傷的研究提供了一條新的修復途徑，其三大支柱是“理想的種子細胞+合適的支架材料+細胞因子”，其中支架材料必須具有以下性能：(1)良好的細胞和組織生物相容性；(2)細胞能在材料表面良好粘附和增殖；(3)

2、材料能夠誘導細胞按預制形態(tài)生長；(4)可控的生物降解吸收性，在新組織長成后，材料能夠在體內(nèi)降解成對人體無毒的小分子，并通過代謝排出體外；(5)具有高孔隙度的三維立體結構；(6)具有可塑性和適宜的力學性能。 目前構建脊髓組織工程的支架材料按來源可分為兩大類，即天然生物材料和人工合成材料。天然生物材料最大優(yōu)點是可降解、生物相容性好，降解產(chǎn)物易于被吸收而不產(chǎn)生炎癥反應，但是存在力學性能差，降解性能不易調(diào)控。人工合成材料中可降解性高分子

3、材料降解速度和強度易調(diào)節(jié)，容易塑型和構建高孔隙度三維支架，但該類生物材料的缺點在于降解產(chǎn)物會對細胞的產(chǎn)生不利影響。 天然生物材料中膠原來源廣泛，具有良好生物相容性和特殊的生物可降解性，降解產(chǎn)物氨基酸可以被機體完全吸收，是最早被應用的天然生物材料。已經(jīng)有研究表明膠原具有特異性的分子識別信號，可促進細胞的粘附和增殖，誘導細胞的分化，可為細胞生長提供支架。然而，由于膠原力學強度和降解速率的限制，使其難以單獨作為組織工程中的支架材料來進

4、行組織器官的體外構建。因此對膠原材料進行改性，在保持其良好的生物相容性基礎上有效提高其力學性能并降低其降解速度，是膠原材料在組織工程中得以廣泛應用的前提。 本實驗擬體外構建天然支架材料膠原并對其進行交聯(lián)改性，并通過支架材料的性能測試和生物相容性研究與人工合成材料PGA，PLGA進行比較。然后選擇脊髓源性神經(jīng)干細胞作為種子細胞接種在篩選出來的支架材料上，再以胚胎脊髓懸浮液(Fetalspinal cord extracts，F(xiàn)SC

5、E)提供NSC生長分化所需的細胞因子和細胞外基質(zhì)，以期構建組織工程化脊髓用于移植修復成年大鼠脊髓損傷。 目的：選擇合適的支架材料，利用組織工程技術構建組織工程化脊髓，研究其在修復成年大鼠脊髓損傷中的作用。 方法：1.神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)和誘導分化。分離和克隆擴增孕14天SD大鼠胚胎脊髓神經(jīng)干細胞，行Nestin免疫熒光染色鑒定；制備FSCE并將其加入到在體外培養(yǎng)的NSC中，并在第3、7天進行免疫熒光細胞化學鑒定，以觀察其對N

6、SC的誘導分化作用。對照組以10％的胎牛血清進行誘導分化。2．組織工程支架材料的選擇。制備鼠尾源性膠原海綿支架，并分別通過化學交聯(lián)(EDC交聯(lián))和物理交聯(lián)(DHT交聯(lián))對支架進行交聯(lián)改性；構建PGA和PLGA支架；通過力學性能測試，孔隙率測定，降解率測定及生物相容性實驗和電鏡掃描來比較上述5種支架材料，并選擇出最為合適的支架材料。3．組織工程化脊髓的體外構建。將神經(jīng)干細胞種植在篩選出來的支架中，以胚胎脊髓提取液對其進行誘導分化72小時，

7、通過HE染色、免疫熒光組織化學檢測和掃描電鏡觀察，了解其組織結構。4．組織工程化脊髓移植修復成年鼠急性脊髓損傷。制作脊髓半橫斷損傷動物模型，A組植入組織工程化脊髓，B組植入神經(jīng)干細胞+支架，c組植入支架材料，D組無移植物。術后3周和8周進行HE染色和免疫熒光組織化學檢查觀察種子細胞的存活和分化情況，并利用改良標準BBB評分和SEP檢查評估動物的運動和感覺功能，了解組織工程化脊髓修復脊髓損傷的效果。 結果： 1．原代和傳代

8、細胞均表達NSC的特有標志物Nestin，NSC生長有3個明顯的分期，即生長緩慢期、對數(shù)生長期和平臺期。FSCE誘導分化3天和7天后，分別有16.37％和18.14％神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元，明顯高于對照組的6.77％和7.69％，二者之間具有顯著的統(tǒng)計學差異(p<0.01)。 2．EDC交聯(lián)的膠原生物相容性與膠原和DHT交聯(lián)的膠原相比無明顯差異，明顯優(yōu)于PGA和PLAG。EDC交聯(lián)的膠原力學性能優(yōu)于膠原和DHT交聯(lián)的膠原，并顯著

9、降低了膠原的體外降解率。 3．體外構建的組織工程化脊髓含有NF200陽性細胞，GFAP陽性細胞及MBP陽性細胞。各種細胞成分均勻散布在三維網(wǎng)絡支架結構中并不斷分化發(fā)育成熟，新生的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞發(fā)出的軸突相互交錯，形成較規(guī)則的網(wǎng)格結構。 4．術后第2周開始到第8周實驗結束，A組和B組的功能評分明顯高于C組和D組的動物，具有顯著的統(tǒng)計學差別(P<0.01)。A組與B組相比，功能恢復更為明顯(P<0.05)。術后第2周開

10、始直至第6周，A組和B組動物的BBB評分恢復均比較迅速。6周以后進入平臺期。術后6周，A組SEP的P<,1>,N<,1>波潛伏期較正常組顯著延長(p<0.01)，但明顯短于B組(p<0.05)，C組和D組(p<0.01)。術后3周和8周的組織學結果表明，A組移植物中大量標記細胞存活，細胞計數(shù)明顯多于B組(P<0.01)。Brdu標記的細胞中，A組有較多NF200陽性細胞出現(xiàn)，GFAP陽性細胞在術后8周形成了規(guī)則的網(wǎng)格結構。而在B組，也有

11、一定數(shù)量的NF200陽性細胞，GFAP細胞形成的網(wǎng)絡結構缺乏規(guī)則，較A組雜亂。C組界面區(qū)也無膠質(zhì)瘢痕過度增生，D組的脊髓缺損區(qū)被瘢痕組織填充。 結論： 1．胚胎脊髓提取液支持神經(jīng)干細胞成活并有效的誘導其分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。 2．采用EDC交聯(lián)制備的膠原海綿保持了膠原固有的良好的生物相容性，同時在細胞培養(yǎng)介質(zhì)中塌陷不明顯，仍保持其形狀和多孔性，體外試驗表明改性膠原降解速度顯著減慢，有利于作為脊

12、髓組織工程中的支架材料。 3．以改性膠原為支架材料，神經(jīng)干細胞為種子細胞，并以胚胎脊髓提取液提供細胞因子和細胞外基質(zhì)所構建的組織工程化脊髓，在體外可進一步成熟并分化，其內(nèi)包含有神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞等成分，有獨特的組織結構。 4．以改性膠原為支架的組織工程化脊髓移植至成年鼠體內(nèi)后，其種子細胞存活并進一步分化，形成功能相活躍的神經(jīng)元，分化的膠質(zhì)細胞形成了較為規(guī)則的的網(wǎng)狀結構。改性膠原為支架的組織工程化脊髓對成年