IL-1β-siRNA聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的實驗研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，關(guān)節(jié)炎發(fā)病在家禽家畜中均有存在，尤其對雞、豬、牛的危害較為嚴重。該病雖然致死率不高，但其一旦發(fā)病便難以痊愈，導(dǎo)致畜禽行動不便，出現(xiàn)發(fā)育遲緩，經(jīng)濟價值降低甚至淘汰，由此給養(yǎng)殖場帶來嚴重損失。已有研究發(fā)現(xiàn)將白細胞介素1受體(IL-1R)基因轉(zhuǎn)染進大鼠，抑制了白細胞介素β(IL-1β)的作用，大鼠RA癥狀可得到明顯改善。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)生物學(xué)特性獨特并且參與多環(huán)節(jié)的免疫調(diào)節(jié)，具

2、有促進損傷的修復(fù)的作用，因而被廣泛應(yīng)用于免疫性疾病的細胞治療。本實驗利用Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)方法制備RA模型大鼠，初步探討RA發(fā)病的免疫機制。研究RA的發(fā)病與IL-1β表達量變化的關(guān)系，并用IL-1β小干擾RNA(SiRNA)體內(nèi)轉(zhuǎn)染結(jié)合BMSCs移植治療RA模型大鼠，研究BMSCs聯(lián)合基因治療對RA的治療效果。
　　1關(guān)節(jié)炎大鼠模型的制備及部分機制的研究
　　采用尾根部散點注射雞Ⅱ型膠原和完全復(fù)氏佐劑乳化液的方法制備類風(fēng)濕性關(guān)

3、節(jié)炎大鼠模型，實驗組分為CIA、AA和正常組，造模后以大鼠足趾腫脹、強迫游泳、DR-X線成像、臟器指數(shù)、關(guān)節(jié)病理切片等進行檢測，篩選出成功RA大鼠模型。通過對成功大鼠模型的血清中IL-1β、脾臟組織Treg的特異性標志物Foxp3及Treg細胞表面的TGF-β1以及凋亡相關(guān)分子PD-1的研究，探討調(diào)節(jié)性T細胞在RA發(fā)生發(fā)展中的意義。
　　結(jié)果顯示，AA模型組和CIA模型組的大鼠體重增長速度下降，CIA模型鼠減緩更明顯，CIA造模組

4、14天內(nèi)關(guān)節(jié)腫脹明顯，21天后大鼠左右關(guān)節(jié)腫脹達到病程的最高峰，30天后部分大鼠關(guān)節(jié)僵直、畸形、表面出現(xiàn)皮膚出現(xiàn)結(jié)節(jié)。CIA組和AA組大鼠脾臟、胸腺占體重指數(shù)極顯著高于正常對照組(p＜0.01);兩模型組大鼠強迫游泳不動時間從造模后1周、2周、3周、4周均極顯著高于正常組(p＜0.01)，掙扎時間均極顯著低于正常對照組(p＜0.01);關(guān)節(jié)滑膜組織切片顯示，大鼠模型關(guān)節(jié)軟骨有明顯的糜爛或潰瘍，滑膜、關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)腔內(nèi)有重度的混合型炎性細

5、胞浸潤，另外還可見有多核巨細胞即肉芽腫的形成。AA模型組和CIA模型組大鼠造模后2周血清中IL-1β含量極顯著高于正常對照組（18.49±1.70 pg/mL、36.98±0.97 pg/mL vs16.23±0.44 pg/mL;p＜0.01），兩模型大鼠PD-1、TGF+1、Foxp3的相對表達量極顯著低于對照組(p＜0.01)，同時CIA模型大鼠脾臟中PD-1、TGF-β1、Foxp3的表達量極顯著低于AA模型大鼠(p＜0.01)

6、。提示采用尾根部散點注射雞Ⅱ型膠原和完全復(fù)氏佐劑乳化液成功建立RA大鼠模型，且模型大鼠血清內(nèi)IL-1β的表達量隨RA病程而上升。RA的發(fā)生可能與調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量的減少或者功能缺陷有關(guān)。
　　2 IL-1β-siRNA干擾BMSCs中IL-1β表達的實驗研究
　　針對RA模型大鼠血清中IL-1β的含量顯著高于正常大鼠的實驗結(jié)果，利用降低動物機體IL-1β分泌技術(shù)，阻止炎癥反應(yīng)進程，本實驗利用LPS體外刺激BMSCs高表達IL-

7、1β，模擬RA體內(nèi)炎癥反應(yīng)，采用siRNA干擾技術(shù)體外干擾BMSCs表達IL-1β，通過ELISA法和Western blot對IL-1β蛋白水平表達變化進行檢測，Q-PCR對IL-1β基因水平的表達變化進行檢測，篩選出最佳IL-1β SiRNA抑制基因。
　　LPS刺激后，LPS-BMSCs組與BMSCs組細胞上清以和裂解物中的IL-1β量存在極顯著差異(p＜0.01)，通過熒光強度篩選siRNA的最佳轉(zhuǎn)染條件為100nMsiR

8、NA與0.5ul轉(zhuǎn)染試劑的組合;siRNA干擾后，BMSCs培養(yǎng)上清中LPS-BMSCs組的IL-1β表達量極顯著高于對照組（347.84±6.17 pg/mL vs119.38±2.92pg/mL; p＜0.01）;LPS+SiRNA157、LPS+SiRNA238、LPS+SiRNA788的表達量分別為126.21±2.25 pg/mL、52.66±1.72 pg/mL、101.83±3.65pg/mL均極顯著低于LPS-BMSCs

9、組(p＜0.01)。三條siRNA序列均可沉默IL-1β的蛋白表達，其中SiRNA238組的IL-1β表達極顯著低于對照組(P＜0.01)。LPS+BMSCs+siRNA157、LPS+BMSCs+siRNA238、LPS+BMSCs+siRNA788的mRNA相對表達量極顯著低于LPS+BMSCs(0.92±0.079、0.28±0.015、0.97±0.174 vs2.74±0.15; p＜0.01)，LPS+BMSCs+siRNA

10、238同時也極顯著低于正常對照組(p＜0.01)。提示LPS刺激BMSCs后成功模擬了體內(nèi)炎性反應(yīng)促進了IL-β在胞內(nèi)外的過表達，蛋白水平、基因水平檢測篩選出IL-1β最佳干擾siRNA238。
　　3.IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠的治療研究
　　本實驗通過IL-1β小干擾RNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染結(jié)合BMSCs移植治療RA模型大鼠，以大鼠生長情況、足趾腫脹、強迫游泳、關(guān)節(jié)病理切片、血清中IL-1β的含量等

11、進行檢測，研究BMSCs聯(lián)合基因治療對RA的治療效果。對治療后老鼠脾臟組織Treg的特異性標志物Foxp3及Treg細胞表面的TGF-β1以及凋亡相關(guān)分子PD-1進行檢測，繼續(xù)探討調(diào)節(jié)性T細胞在RA發(fā)生發(fā)展中的意義。
　　IL-1β SiRNA238治療組和IL-1β SiRNA238+BMSCs治療組大鼠的體重增長、足趾腫脹較PBS治療組都極顯著升高(p＜0.01)，IL-1β SiRNA+BMSCs治療組升高更明顯。IL-1β

12、 SiRNA治療組和IL-1β SiRNA+BMSCs治療組大鼠強迫游泳不動時間在治療后1周、2周極顯著低于治療對照組(p＜0.01)。治療后1周、2周、3周IL-1β SiRNA238+BMSCs治療組大鼠掙扎時間都極顯著高于IL-1β SiRNA238治療組(p＜0.01)。治療后1周、2周IL-1β SiRNA治療組大鼠和IL-1β SiRNA+BMSCs治療組大鼠血清中IL-1β的濃度極顯著低于PBS治療對照組(p＜0.01)，

13、且治療后1周、2周IL-1β SiRNA238+BMSCs治療組大鼠血清中IL-1β的濃度都極顯著高于IL-1β SiRNA238治療組(p＜0.01)。IL-1β SiRNA238治療組PD-1、TGF-β1、Foxp3的相對表達量極顯著高于治療對照組(p＜0.01)，IL-1βSiRNA+BMSCs治療組PD-1、TGF-β1、Foxp3的相對表達量極顯著高于治療對照組(p＜0.01)，IL-1β SiRNA+BMSCs治療組大鼠脾