白背飛虱與灰飛虱的微衛(wèi)星開發(fā)及種群遺傳結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、白背飛虱Sogatella furcifera（Horváth）與灰飛虱Laodelphax striatellus(Fallén)同屬半翅目，飛虱科。這兩種飛虱是目前為害我國水稻生產(chǎn)的最主要的兩種飛虱科害蟲。白背飛虱被認(rèn)為有遠(yuǎn)距離遷飛習(xí)性，一直以來對(duì)其確切的蟲源地和遷飛線路尚存爭(zhēng)議，但該研究因?yàn)槿狈τ行У姆肿訕?biāo)記尚處于停滯階段。而灰飛虱在我國一般被認(rèn)為是本地蟲源，雖然國外不少研究認(rèn)為其具備遠(yuǎn)距離飛行能力，但是對(duì)于其遷移能力的分子遺傳學(xué)

2、研究卻很少。因此，利用有效的分子標(biāo)記手段對(duì)這兩種飛虱不同的地理種群進(jìn)行分析，能夠從遺傳學(xué)的角度揭示這兩種飛虱可能的遷飛路徑，并反映出它們?cè)谶w飛過程中種群遺傳結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化與遺傳特性。在目前的種群遺傳學(xué)研究中，分布于生物核基因組中的微衛(wèi)星標(biāo)記與分布在線粒體當(dāng)中的細(xì)胞色素氧化酶亞基基因是較為常用的兩種分子標(biāo)記手段。利用微衛(wèi)星標(biāo)記和線粒體DNA序列能夠研究種群多樣性、種群遷移、種群結(jié)構(gòu)等一系列種群遺傳學(xué)內(nèi)容。因此，本研究中，我們使用了兩種分子

3、遺傳標(biāo)記:微衛(wèi)星及線粒體COⅡ基因?qū)Π妆筹w虱和灰飛虱分別進(jìn)行了微衛(wèi)星開發(fā)和基于兩種標(biāo)記的種群遺傳學(xué)研究。
　　在基于微衛(wèi)星標(biāo)記的研究中，我們首先通過挖掘兩種飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)EST-SSR的方法分別對(duì)白背飛虱和灰飛虱兩種飛虱成功開發(fā)了19個(gè)和7個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記。在此基礎(chǔ)上，我們成功構(gòu)建了19個(gè)白背飛虱微衛(wèi)星標(biāo)記的熒光多重PCR體系。并以這些新的微衛(wèi)星位點(diǎn)為基礎(chǔ)進(jìn)行了我國5個(gè)地理種群的白背飛虱種群扣3個(gè)地理種群的灰飛虱遺傳學(xué)的初步研

4、究，為進(jìn)一步進(jìn)行兩種飛虱的種群遺傳學(xué)研究和遷飛路徑研究打下基礎(chǔ)。獲得以下主要結(jié)果:
　　(1)本研究自白背飛虱的Short Read Archive數(shù)據(jù)庫下載白背飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)拼接處理，設(shè)計(jì)663引物并篩選出了220對(duì)引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，最終篩選得到了19個(gè)多態(tài)性較好的白背飛虱微衛(wèi)星標(biāo)記。并依據(jù)同樣的方法開發(fā)了7個(gè)灰飛虱微衛(wèi)星位點(diǎn)。
　　(2)對(duì)19個(gè)新開發(fā)的白背飛虱微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行熒光多重PCR組合篩選、并

5、對(duì)多重PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。最終將19個(gè)多態(tài)性較好的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)為4組不同的多重PCR組合，每組中含有4-7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)。該體系的建立大大提高了本研究中微衛(wèi)星的分型效率。
　　(3)通過5個(gè)白背飛虱地理種群對(duì)新開發(fā)的19對(duì)微衛(wèi)星引物進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。共檢測(cè)到156個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)具有3-14個(gè)等位基因，平均等位基因數(shù)為6.8個(gè)。5個(gè)種群的表觀雜合度0.105-0.766之間，預(yù)期雜合度在0.099-0.783之間。這

6、19個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)性水平較高，每個(gè)種群各位點(diǎn)的平均等位基因豐富度在4.4-5.0之間。總體FST僅有0.003，顯示出5個(gè)種群之間的分化程度很小。只有文山與龍巖種群之間分化相對(duì)較顯著，F(xiàn)ST=0.0073，但所有的FST值均沒有達(dá)到顯著水平。
　　(4)通過3個(gè)灰飛虱地理種群對(duì)這7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的評(píng)測(cè)發(fā)現(xiàn)這7個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)性較好。平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)介于5-14個(gè)，平均為9個(gè)。其中哈爾濱種群平均為9個(gè)，上海種群等位基因數(shù)均值最高，為9

7、.7，而龍巖種群均值為8.3，在三個(gè)種群當(dāng)中最低。三個(gè)種群的表觀雜合度和預(yù)期雜合度分別在0.542到0.971和0.604到0.876之間。這7個(gè)位點(diǎn)在129個(gè)研究個(gè)體中都能成功地?cái)U(kuò)增并具有清晰的帶型。
　　另外，在基于線粒體分子標(biāo)記的研究中，我們利用一段線粒體COⅡ基因序列對(duì)中國26個(gè)灰飛虱地理種群共計(jì)1144個(gè)灰飛虱個(gè)體展開種群遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究，得到相關(guān)的結(jié)果與結(jié)論如下:
　　(1)本研究所使用的線粒體CO

8、Ⅱ片段長度為650bp，共有42個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)13個(gè)，單一多態(tài)位點(diǎn)27個(gè)。所有序列沒有插入和缺失，并且三個(gè)基因都表現(xiàn)出堿基偏倚性，A+T含量明顯高于G+C含量，符合昆蟲線粒體DNA堿基組成。全部序列可被分類為46個(gè)單倍型，其中11個(gè)為共享單倍型，35個(gè)為私有單倍型。單倍型多樣性較好，在0.22與0.82之間，平均為0.596;而核酸多樣性較差，在0.037％-0.222％之間，平均0.132％。東北地區(qū)的灰飛虱多樣性較差

9、，平均每個(gè)種群有5個(gè)單倍型，其中最差的是牡丹江種群，僅有2個(gè)單倍型，并且沒有私有單倍型。
　　(2)種群間分化指數(shù)FST值在絕大多數(shù)種群間都不顯著，說明各種群之間總體分化較弱。但值得注意的是，黑龍江的牡丹江種群以及哈爾濱種群與其他種群分化程度較強(qiáng)，F(xiàn)ST值顯示這兩個(gè)種群與其它種群有較顯著的差異，部分FST值在0.1-0.4之間。距離隔離效應(yīng)分析結(jié)果顯示，雖然相關(guān)系數(shù)很低，但種群的分化程度與地理距離顯著的正相關(guān)性。中性檢測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)