二斑葉螨與灰飛虱的微衛(wèi)星開(kāi)發(fā)及種群遺傳結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、朱砂葉螨Tetranychus cinnabarinus(Boisduval)和二斑葉螨T.urticae Koch屬于蛛形綱Arachnida、蜱螨亞綱Acari、真螨目Acariformes、葉螨科Tetranychidae，是農(nóng)林生產(chǎn)中十分重要的害螨。這兩種葉螨具有多種擴(kuò)散機(jī)制，由于葉螨無(wú)翅，通常依靠爬行進(jìn)行擴(kuò)散;但它們也可以借助風(fēng)和人類活動(dòng)進(jìn)行遠(yuǎn)距離的傳播;葉螨復(fù)雜的擴(kuò)散機(jī)制可能導(dǎo)致復(fù)雜的種群遺傳結(jié)構(gòu)。但是，由于這兩種葉螨體內(nèi)可

2、用的分子標(biāo)記較少，導(dǎo)致我國(guó)這兩種葉螨的種群遺傳多樣和種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究相對(duì)滯后。此外，在中國(guó)，朱砂葉螨與二斑葉螨兩種葉螨并存，紅色型被認(rèn)為是本地種，而綠色型的變種被認(rèn)為是入侵種。朱砂葉螨和二斑葉螨在歐美被認(rèn)為是二斑葉螨的不同色型，因?yàn)閮烧呖梢宰杂山慌?，形態(tài)學(xué)和線粒體DNA水平上難以找出差別;而在中國(guó)等亞洲國(guó)家兩者被認(rèn)為是兩種不同的螨類，理由是成螨體色差異較大，遺傳雜交實(shí)驗(yàn)常得到不親和的結(jié)果。二者的分類地位一直存在較大爭(zhēng)論。
　　

3、 針對(duì)以上問(wèn)題筆者首先通過(guò)抑制PCR的方法成功構(gòu)建了微衛(wèi)星富集文庫(kù)來(lái)，開(kāi)發(fā)葉螨微衛(wèi)星分子標(biāo)記;并結(jié)合以前報(bào)道的微衛(wèi)星分子標(biāo)記研究了我國(guó)25個(gè)地理種群的二斑葉螨和朱砂葉螨的種群遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)，比較了兩者種群遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)的差異，并從種群生態(tài)學(xué)的角度探討朱砂葉螨與二斑葉螨的分類進(jìn)化地位，獲得以下結(jié)果與結(jié)論:
　　 1)通過(guò)葉螨的基因組DNA提取純化、酶切、接頭連接及抑制PCR擴(kuò)增等步驟成功構(gòu)建了二斑葉螨微衛(wèi)星富集

4、文庫(kù)，挑取180個(gè)陽(yáng)性克隆成功測(cè)序，并設(shè)計(jì)了53對(duì)微衛(wèi)星引物，最后成功獲得2個(gè)多態(tài)性較好的微衛(wèi)星標(biāo)記。本研究是首次通過(guò)抑制PCR的方法構(gòu)建葉螨的微衛(wèi)星富集文庫(kù)來(lái)開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星，通過(guò)此研究，我們得出結(jié)論，葉螨體內(nèi)微衛(wèi)星變異速率較低嚴(yán)重的影響了微衛(wèi)星開(kāi)發(fā)效率。
　　 2)結(jié)合筆者剛開(kāi)發(fā)的2個(gè)微衛(wèi)星及以前報(bào)道的6個(gè)微衛(wèi)星，對(duì)中國(guó)18個(gè)朱砂葉螨種群和7個(gè)二斑葉螨種群，共計(jì)1055個(gè)葉螨樣本進(jìn)行了種群遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)分析。8個(gè)微衛(wèi)星位

5、點(diǎn)共檢測(cè)到109個(gè)等位基因。平均每個(gè)位點(diǎn)13.63個(gè)等位基因。然而，平均每個(gè)種群每個(gè)位點(diǎn)等位基因豐富度和雜合度都較低，表明我國(guó)的葉螨種群遺傳多樣性較差。對(duì)朱砂葉螨和二斑葉螨的等位基因豐富度和預(yù)期雜合度的T測(cè)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):我國(guó)的二斑葉螨的多樣性顯著低于朱砂葉螨，這可能是由于朱砂葉螨是本地種，而二斑葉螨是入侵種，在入侵過(guò)程中發(fā)生瓶頸效應(yīng)造成的。通過(guò)等位基因豐富度和預(yù)期雜合度（AR和HE）與地理坐標(biāo)（經(jīng)度和緯度）之間的皮爾遜相關(guān)性分析表明，朱砂葉螨

6、的遺傳多樣性與緯度成正相關(guān)性，這是由于低緯度地區(qū)的朱砂葉螨每年發(fā)生的代數(shù)較多，維持了較高的遺傳多樣性。Hardy-Weinberg平衡測(cè)試顯示25個(gè)種群里面有23個(gè)種群因?yàn)殡s合體缺失而偏離了平衡，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)無(wú)效等位基因的存在是引起偏離平衡的重要因素。
　　 3)25個(gè)葉螨種群的總體分化指數(shù)FST為0.506，種群之間高度遺傳分化。種群間基因流較小，種群多樣性較差及存在地理隔離效應(yīng)是引起朱砂葉螨種群分化的重要因素。通過(guò)構(gòu)建NJ

7、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、貝葉斯聚類及分子變異模型分析(AMOVA)，結(jié)果顯示我國(guó)的葉螨種群分為五個(gè)分支，其中朱砂葉螨的聚類結(jié)果與地理分布有很好的相關(guān)性。此外，我們的遺傳數(shù)據(jù)不支持將兩種形式的葉螨分成兩個(gè)物種，因?yàn)閮烧叩姆只教幱诓煌乩矸N群的分化水平，兩者在DNA組成上沒(méi)有實(shí)質(zhì)的不同，體色的差異可能由于表觀遺傳方式的不同造成的。
　　 灰飛虱Laodelphax striatellus(Fallén)屬半翅目飛虱科，世界范圍內(nèi)主要分布在溫

8、帶地區(qū)，廣泛分布于東亞、東南亞、歐洲和北非等地，可在溫帶地區(qū)安全越冬。國(guó)內(nèi)分布遍及全國(guó)各地，以長(zhǎng)江流域和華北稻區(qū)發(fā)生較多?；绎w虱除以成蟲(chóng)、若蟲(chóng)刺吸危害外，還是多種植物病毒病害的重要媒介昆蟲(chóng)，可傳播多種病毒病害，其傳毒危害造成的損失遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其刺吸危害。盡管灰飛虱的經(jīng)濟(jì)地位重要，但是對(duì)于灰飛虱的種群遺傳學(xué)的研究報(bào)道卻比較少。原因在于灰飛虱上可用的遺傳標(biāo)記較少，且不能提供足夠的遺傳學(xué)信息。而微衛(wèi)星(microsatellite)分子標(biāo)記由于廣

9、泛地在基因組中分布、良好的重復(fù)性和保真性、較高的變異頻率、呈孟德?tīng)柺竭z傳、共顯性等優(yōu)點(diǎn)，已成為種群遺傳學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的分子標(biāo)記。但是，目前尚未有灰飛虱微衛(wèi)星的開(kāi)發(fā)的報(bào)道?；谝陨显?，筆者分別通過(guò)褐飛虱EST數(shù)據(jù)庫(kù)和抑制PCR構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫(kù)來(lái)開(kāi)發(fā)灰飛虱的微衛(wèi)星，并應(yīng)用新開(kāi)發(fā)的9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記和一段線粒體COI基因的序列對(duì)中國(guó)17個(gè)地理種群共計(jì)720個(gè)灰飛虱個(gè)體展開(kāi)種群遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究，并得到相關(guān)的結(jié)果與結(jié)論:

10、>　　 1)由于國(guó)際無(wú)灰飛虱微衛(wèi)星的報(bào)道，基于EST微衛(wèi)星具有較高的不同種屬之間的轉(zhuǎn)移性、開(kāi)發(fā)成本低和效率高的特性，首先根據(jù)褐飛虱的EST數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)發(fā)褐飛虱的微衛(wèi)星，然后驗(yàn)證在其灰飛虱上的轉(zhuǎn)移性。筆者通過(guò)搜索褐飛虱的EST數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)引物并PCR驗(yàn)證，最終開(kāi)發(fā)了12個(gè)多態(tài)性較好的褐飛虱微衛(wèi)星標(biāo)記。微衛(wèi)星等位基因的測(cè)序結(jié)果揭示了微衛(wèi)星復(fù)雜的變異機(jī)制。對(duì)這12對(duì)微衛(wèi)星引物在灰飛虱上面的轉(zhuǎn)移性研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):這12對(duì)衛(wèi)星引物高度專屬于褐飛虱，不

11、能夠用于灰飛虱。我們得出結(jié)論:灰飛虱與褐飛虱屬于不同的屬，分化時(shí)間較長(zhǎng)，且進(jìn)化速度較快，兩者的基因組信息差異太大，導(dǎo)致兩者之間的微衛(wèi)星不能相互轉(zhuǎn)移。
　　 2)通過(guò)抑制PCR的方法構(gòu)建了灰飛虱(TC)6(AC)5和(AG)6(AC)5的復(fù)合型微衛(wèi)星富集文庫(kù)，挑取200個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序，設(shè)計(jì)了100對(duì)微衛(wèi)星引物，最終成功開(kāi)發(fā)了9個(gè)多態(tài)性較好的微衛(wèi)星，通過(guò)三個(gè)地理種群對(duì)新開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示每個(gè)位點(diǎn)具有13到30個(gè)等位基因。

12、平均表觀雜合度和預(yù)期雜合度分別在在0.255～0.833和0.392～0.929之間，這9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)具有高度的多態(tài)性，新開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星位點(diǎn)將為灰飛虱種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究提供有效的分子標(biāo)記手段，本研究首次在國(guó)際上報(bào)道了9個(gè)灰飛虱微衛(wèi)星，填補(bǔ)了國(guó)際無(wú)灰飛虱微衛(wèi)星的空白。
　　 3)運(yùn)用9個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記對(duì)17個(gè)地理種群的灰飛虱種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究，結(jié)果顯示每個(gè)種群平均每個(gè)位點(diǎn)的等位基因個(gè)數(shù)在12.111～16.333之間。所有種群的表觀

13、雜合度介于0.536～0.683之間，預(yù)期雜合度介于0.742～0.840之間。說(shuō)明我國(guó)的灰飛虱具有較高水平的遺傳多樣性，并且華東種群和華北種群較東北種群和華南種群的多樣性要高。由于灰飛虱的近交導(dǎo)致大部分種群因雜合體缺失而偏離Hardy-Weinberg平衡。除了華南的永福和南寧種群外，其他種群都具有私有等位基因，這可能是由于華南地區(qū)的分析樣本較少造成的。基于FST統(tǒng)計(jì)顯示種群間分化較小或無(wú)分化，總體FST為0.004，只有東北的黑龍江

14、HLJ種群和遼寧的丹東DD種群與其他種群有較微弱的顯著分化，貝葉斯聚類及NJ分析結(jié)果同樣顯示17個(gè)種群具有不穩(wěn)定的種群遺傳結(jié)構(gòu)黑龍江HLJ種群和遼寧的丹東DD種群與其他種群有較微弱的差異。AMOVA分析結(jié)果表明灰飛虱的微弱變異主要來(lái)自個(gè)體之間的差異，而種群間及4個(gè)區(qū)域間的遺傳分化極小。與地理距離的相關(guān)性分析結(jié)果表明，盡管灰飛虱的遺傳分化水平較低，但是與地理距離還有較弱的負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明地理距離在灰飛虱種群分化中起一定作用。
　　

15、4)基于線粒體一段COI基因序列對(duì)種群的研究發(fā)現(xiàn)，COI基因經(jīng)比對(duì)并去掉引物及測(cè)序較差的部分后，最終得到了769bp的片段，沒(méi)有終止密碼子堿基的插入或缺失出現(xiàn)，共有33個(gè)變異位點(diǎn)，占總序列的4.2％，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)15個(gè)?？傮w來(lái)說(shuō)灰飛虱多樣性較好，在720個(gè)個(gè)體中共發(fā)現(xiàn)了37個(gè)單倍型，單倍型多樣性指數(shù)0.159～0.764之間，平均0.642;核酸多樣性較差，在0.101％～0.320％之間，平均0.217％。與微衛(wèi)星的結(jié)果相似，華東

16、種群較東北種群和華南種群的多樣性要高;東北地區(qū)的灰飛虱多樣性較差，平均每個(gè)種群有5.5個(gè)單倍型，并且這四個(gè)種群中無(wú)私有單倍型存在。其中最差的是黑龍江HLJ種群，只有3個(gè)單倍型。COI基因的FST統(tǒng)計(jì)比微衛(wèi)星的結(jié)果稍大，但還是處于較低分化的水平，平均分化指數(shù)為0.055，表明灰飛虱的確分化較小或無(wú)分化。COI的分析同樣表明東北的黑龍江種群與其他種群有顯著分化。AMOVA分析結(jié)果同樣顯示灰飛虱的微弱變異主要來(lái)自個(gè)體之間的差異。
　　

17、 5)根據(jù)微衛(wèi)星和COI基因?qū)绎w虱種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究，我們得出結(jié)論:灰飛虱種群分化水平較低，分化程度與具有遷飛習(xí)性的東亞飛蝗相似，種群間基因流較強(qiáng)，灰飛虱可能具有遠(yuǎn)距離遷飛習(xí)性?；贑OI基因的分析發(fā)現(xiàn)37個(gè)單倍型在各個(gè)種群中分布不均勻，這可能是由于環(huán)境選擇壓力的不同造成，單倍型與灰飛虱的適合度及遷飛是否有某種聯(lián)系需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，另外，我們還發(fā)現(xiàn)灰飛虱感染的Wolbachia沒(méi)有引起單倍型多樣性的降低，但導(dǎo)致了核酸多樣性的降低，