StRFP1在馬鈴薯晚疫病抗性中的作用研究.pdf

1、馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是世界四大糧食作物之一，在保障世界糧食安全中起著重要作用。馬鈴薯生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害是由卵菌致病疫霉(Phytophthora infestans(Mont.)de Bary)引起的晚疫病。系統(tǒng)解析馬鈴薯晚疫病抗性機(jī)制，對(duì)于探索和尋找晚疫病防治策略，指導(dǎo)抗病育種和晚疫病科學(xué)防治具有重要意義。大量研究證明翻譯后修飾在植物PTI和ETI免疫應(yīng)答中起重要的作用。通過泛素化調(diào)節(jié)蛋白的穩(wěn)定性是重要的

2、轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控途徑之一。許多RING類型的E3s參與植物免疫信號(hào)的傳遞和調(diào)節(jié)。ATL家族是帶有RING類型的泛素連接酶蛋白，包含跨膜結(jié)構(gòu)域、GLD結(jié)構(gòu)域和RING結(jié)構(gòu)域，ATL家族的蛋白廣泛參與調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗病抗逆反應(yīng)。前期研究表明馬鈴薯ATL家族基因StRFP1參與晚疫病抗性，本研究克隆了茄科抗病研究模式植物本氏煙中StRFP1的同源基因NbATL60，在馬鈴薯和本氏煙中進(jìn)一步系統(tǒng)深入研究了StRFP1在免疫應(yīng)答調(diào)控中的作用

3、。主要研究結(jié)果如下:
　　1.通過檢測(cè)晚疫病菌培養(yǎng)液（CF，含有潛在晚疫病菌PAMPs）和PAMPs flg22處理后馬鈴薯和本氏煙中StRFP1和NbATL60的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因均能夠強(qiáng)烈響應(yīng)CF和flg22的誘導(dǎo)表達(dá)，表明StRFP1和NbATL60參與茄科植物的PTI應(yīng)答。
　　2.StRFP1和NbATL60具有預(yù)測(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)域，激光共聚焦顯微觀察表明StRFP1-GFP和NbATL60-GFP蛋白主要分布在

4、細(xì)胞膜上，同時(shí)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞內(nèi)觀察到很強(qiáng)的點(diǎn)狀熒光信號(hào)，預(yù)示這兩個(gè)蛋白在膜和胞內(nèi)存在動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)。另外，顯微觀察發(fā)現(xiàn)，CF和flg22處理不會(huì)影響瞬時(shí)表達(dá)StRFP1和NbATL60的亞細(xì)胞定位。
　　3.體外泛素活性檢測(cè)研究表明，去除跨膜域的原核表達(dá)蛋白StRFP137-262和NbATL6034-256具有E3泛素連接活性。突變RING finger結(jié)構(gòu)域的StRFP137-262(H124A)和NbATL6034-256(H127

5、A)喪失泛素活性，證明RING finger結(jié)構(gòu)域是E3泛素連接活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。
　　4.用強(qiáng)毒力晚疫病菌小種進(jìn)一步鑒定馬鈴薯StRFP1超量和干涉轉(zhuǎn)基因株系晚疫病抗性，結(jié)果表明超量株系抗性提高，干涉株系抗性下降。同時(shí)在本氏煙上瞬時(shí)表達(dá)StRFP1-MYC和NbATL60-MYC后顯著提高晚疫病抗性，但是瞬時(shí)表達(dá)喪失泛素活性的RING finger突變體StRFP1-mut-MYC和NbATL60-mut-MYC則不能抑制晚疫病

6、菌擴(kuò)展，表明E3泛素連接酶活性是StRFP1和NbATL60實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)控功能所必需的。
　　5.利用病毒介導(dǎo)的基因沉默(VIGS)方法在本氏煙中沉默NbATL60。發(fā)現(xiàn)沉默株系表現(xiàn)明顯的矮化表型，預(yù)示NbATL60參與調(diào)節(jié)植株生長(zhǎng)發(fā)育。抗性評(píng)價(jià)表明VIGS NbATL60本氏煙晚疫病抗性顯著下降。表明StRFP1和NbATL60在調(diào)控晚疫病抗性免疫應(yīng)答中具有相同的功能。已有研究顯示，部分ATLs參與調(diào)控細(xì)胞死亡，本研究發(fā)現(xiàn)沉默Nb

7、ATL60不能抑制晚疫病菌PAMP INF1以及R基因及相應(yīng)無毒基因?qū)x/Cp、R2/Avr、R3a/Avr3a和Pto/AvrPto誘發(fā)的細(xì)胞死亡。
　　6.在StRFP1馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系和VIGS沉默NbATL60本氏煙中檢測(cè)了4個(gè)PTI途徑marker基因?qū)F和flg22的響應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中WRKY7、WRKY8和ACRE31表達(dá)極顯著增加，而在干涉株系中4個(gè)PTI marker基因均下調(diào)表達(dá)。在VIG

8、S沉默NbATL60本氏煙中，N6WRKY7，N6WRKY7，NbACRE31和NbPti5均表現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。因此，StRFP1和NbATL60均參與調(diào)控PTI途徑抗病防御基因的表達(dá)。
　　7.為了進(jìn)一步探究StRFP1在植物免疫中如何與其靶標(biāo)結(jié)合發(fā)揮功能，本研從膜系統(tǒng)酵母文庫(kù)篩選出71個(gè)陽(yáng)性克隆，通過酵母點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)3個(gè)強(qiáng)互作蛋白Stβ-GLU08、StHMA和StLD以及兩個(gè)弱互作蛋白StACY和St14-3-3。黃色熒光互