膠質(zhì)瘤缺氧轉(zhuǎn)錄與代謝表征的生物意義和肺癌IF1表達(dá)的臨床意義.pdf

1、文章主要從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分:缺氧對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞基因表達(dá)和物質(zhì)代謝的影響及其生物學(xué)意義
　　目的:
　　膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤，其中惡性膠質(zhì)瘤具有生存期短、易復(fù)發(fā)及難治療的特點(diǎn)。盡管近年來(lái)有大量的研究，從細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床水平探討揭示了惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，并從手術(shù)、放療、化療、基因、靶向、免疫等方面深入探討了惡性膠質(zhì)瘤的綜合治療方法。但是目前惡性膠質(zhì)瘤患者術(shù)后平均生存期仍然不到1年，且

2、大部分膠質(zhì)瘤表現(xiàn)出對(duì)放化療極強(qiáng)的耐受性。其關(guān)鍵在于目前尚缺乏可用于惡性膠質(zhì)瘤早期診斷的特異性標(biāo)志物，以及可指導(dǎo)臨床進(jìn)行靶向治療的特異性干預(yù)靶點(diǎn)。因此，積極研究尋找惡性膠質(zhì)瘤的特異性標(biāo)志物和特異性干預(yù)靶點(diǎn)對(duì)提高治療質(zhì)量具有重要的理論意義和巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)和代謝物檢測(cè)分析技術(shù)的快速發(fā)展，為從基因及代謝產(chǎn)物等分子水平揭示惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、尋找特異性生物標(biāo)志物及特異性干預(yù)靶點(diǎn)提供了新的技術(shù)手段和實(shí)現(xiàn)路徑，因而在惡

3、性腫瘤的研究中得以廣泛應(yīng)用。惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖、侵襲、耐藥以及高復(fù)發(fā)等特性除了與膠質(zhì)瘤細(xì)胞自身的特性有關(guān)外，還與其以缺氧為特征的腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)。但是，迄今為止，有關(guān)缺氧在膠質(zhì)瘤細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄和物質(zhì)代謝改變過(guò)程中的作用及其生物學(xué)意義尚不十分清楚。因此，本研究采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)方法系統(tǒng)研究了常氧及缺氧條件下惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄和代謝物改變的表征，采用生物信息學(xué)方法分析揭示了惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中活化的生物過(guò)程和信號(hào)通路及其關(guān)鍵

4、分子，并結(jié)合CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)及惡性膠質(zhì)瘤患者的組織和血液樣本對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證，不僅為深入揭示惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新的視角，而且為尋找惡性膠質(zhì)瘤生物標(biāo)志物及特異性治療靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，最終為惡性膠質(zhì)瘤患者的個(gè)性化治療提供了可能，對(duì)提高惡性膠質(zhì)瘤的治療水平具有重要的理論意義和潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:
　　1.轉(zhuǎn)錄組學(xué)生物信息分析
　　以正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HEB和惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG作為模型，于21％和1％O2

5、環(huán)境培養(yǎng)24h收集細(xì)胞總RNA行RNA-Seq檢測(cè)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)經(jīng)原始測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估及比對(duì)到人類(lèi)參考基因組(hg19)后，采用R軟件包Nioseq計(jì)算差異表達(dá)基因，選取差異倍數(shù)≥2及偏離概率值≥0.8為顯著性閾值，篩選差異表達(dá)基因。根據(jù)上調(diào)差異基因在U87-MG細(xì)胞中的表達(dá)量值FPKM，選取FPKM≥1000、10≤FPKM＜1000及FPKM＜10為閾值將上調(diào)差異基因分為高表達(dá)、中度表達(dá)和低表達(dá)三類(lèi)，以高表達(dá)組作為U87-MG細(xì)胞的特

6、征性表達(dá)基因，結(jié)合蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)IntAct、MINT、MatrixDB、DIP、I2D和InnateDB分析U87-MG細(xì)胞的生物學(xué)功能。使用Enrichr及REVIGO在線分析工具對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路分析。隨后使用CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的U87-MG細(xì)胞核心通路及特征表達(dá)基因進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。以HEB細(xì)胞對(duì)缺氧環(huán)境的應(yīng)答過(guò)程作為背景，結(jié)合CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)中惡性膠質(zhì)瘤各細(xì)胞系表達(dá)譜篩選在U87-MG細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)的

7、缺氧敏感性基因，并使用蛋白印跡在細(xì)胞中對(duì)STC1、HMOX1和TGFB1的蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
　　2.GBM患者血液及組織標(biāo)本驗(yàn)證關(guān)鍵分子
　　收集GBM病人血液及組織標(biāo)本，離心后獲取血漿樣品，使用ELISA法對(duì)GBM病人血漿標(biāo)本中炎癥相關(guān)分子IL1B、CSF3和TIMP1蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，采用免疫組化技術(shù)在GBM患者中對(duì)缺氧敏感基因STC1、HMOX1和TGFB1的蛋白表達(dá)及分布進(jìn)行檢測(cè)。
　　3.代謝組學(xué)分析

8、r>　　以HEB和U87-MG細(xì)胞系作為模型，分別于21％和1％O2環(huán)境培養(yǎng)24h收集細(xì)胞行代謝組學(xué)檢測(cè)。樣本在質(zhì)量控制的基礎(chǔ)上，行液相色譜-質(zhì)譜分析得到色譜數(shù)據(jù)。通過(guò)R軟件提取色譜峰，進(jìn)一步進(jìn)行內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化和細(xì)胞數(shù)校準(zhǔn)后。之后我們通過(guò)數(shù)據(jù)多變量統(tǒng)計(jì)分析(SIMCA-P12.0)和單變量統(tǒng)計(jì)分析(SPSS19.0)，得到常氧U87-MG相較于HEB細(xì)胞以及缺氧環(huán)境下U87-MG和HEB細(xì)胞相較于其自身常氧的差異代謝物。通過(guò)在HMDB和ME

9、TLIN數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證后，使用MetaboAnalyst3.0進(jìn)行通路富集分析，結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，繪制代謝通路示意圖。進(jìn)一步結(jié)合分析轉(zhuǎn)錄組中代謝酶的變化，探討膠質(zhì)瘤的代謝表征和缺氧后的物質(zhì)代謝變化。
　　結(jié)果:
　　1.與HEB細(xì)胞相比，在U87-MG細(xì)胞中共有5215個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因2759個(gè)，下調(diào)基因2456個(gè)。上調(diào)基因主要富集在炎癥反應(yīng)、血管生成及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等生物學(xué)過(guò)程，其中炎癥反應(yīng)主要活化的通路為細(xì)胞因子

10、間相互作用及Toll樣受體通路。
　　2.U87-MG細(xì)胞差異上調(diào)基因中，篩選到特征表達(dá)基因12個(gè)，且其參與的通路均與炎癥反應(yīng)、血管生成及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)。其中惡性膠質(zhì)瘤患者IL1B、CSF3和TIMP1蛋白表達(dá)量顯著高于健康體檢者。
　　3.U87-MG細(xì)胞缺氧過(guò)程中，細(xì)胞分裂、DNA復(fù)制、三羧酸循環(huán)、線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)及ATP代謝過(guò)程受到抑制，而細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)及脂質(zhì)的細(xì)胞應(yīng)答過(guò)程被激活。
　　4.缺氧敏感基因STC1、HMOX

11、1和TGFB1在U87-MG細(xì)胞中持續(xù)性高表達(dá)，且惡性膠質(zhì)瘤患者腦組織中其蛋白表達(dá)顯著高于正常腦組織。
　　5.U87-MG細(xì)胞與HEB細(xì)胞差異代謝物共119個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)59個(gè)，下調(diào)60個(gè)，主要富集于三羧酸循環(huán)、脂質(zhì)代謝、糖酵解、氨基酸及核酸代謝通路等代謝過(guò)程。與正常細(xì)胞HEB相比，膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG糖酵解增強(qiáng)，氨基酸和脂代謝增強(qiáng)，但有氧氧化和核酸代謝減弱。
　　6.1％O2環(huán)境處理U87-MG細(xì)胞時(shí)，氨基酸代謝和糖

12、代謝的增強(qiáng)更為顯著。而1％O2環(huán)境處理HEB細(xì)胞時(shí)，脂肪酸合成和代謝則更為旺盛。
　　結(jié)論:
　　HEB和U87-MG細(xì)胞之間基因表達(dá)差異顯著，U87-MG細(xì)胞中炎癥反應(yīng)、血管生成及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等生物學(xué)過(guò)程明顯活化。炎癥相關(guān)的Toll樣受體通路及細(xì)胞因子間相互作用信號(hào)通路在U87-MG細(xì)胞呈現(xiàn)高度活躍狀態(tài)。HEB和U87-MG細(xì)胞對(duì)缺氧刺激的應(yīng)答模式明顯不同，U87-MG細(xì)胞中，細(xì)胞分裂、DNA復(fù)制、三羧酸循環(huán)、線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)及AT

13、P代謝過(guò)程受到抑制，而細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)及脂質(zhì)的細(xì)胞應(yīng)答過(guò)程被激活。同時(shí)炎癥相關(guān)因子IL1B、CSF3和TIMP1及缺氧敏感基因STC1、HMOX1和TGFB1有望成為GBM患者臨床早期診斷及組織病理診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。同時(shí)在代謝產(chǎn)物上，與HEB細(xì)胞相比U87-MG細(xì)胞糖酵解增強(qiáng)，氨基酸和脂代謝增強(qiáng)，但有氧氧化和核酸代謝減弱，而在缺氧時(shí)，氨基酸代謝和糖代謝的增強(qiáng)更為顯著。
　　第二部分:IF1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義

14、
　　目的:
　　肺癌是當(dāng)前世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lungcancer，NSCLC)在總的肺癌病人中占比高達(dá)85％。雖然目前NSCLC的手術(shù)治療、放療、化療以及基因治療方法已有較大進(jìn)步，但治療效果仍然十分有限，總的治愈率在10％左右。其中主要原因是NSCLC的生物學(xué)特性復(fù)雜，惡性程度高，80％的肺癌患者在首次就診時(shí)已是晚期，因此，尋找新的腫瘤標(biāo)志物是未來(lái)肺癌治療的突破口之

15、一。ATP合酶抑制因子1(ATPase inhibitory factor1，IF1)在多種腫瘤中高表達(dá)，并且參與了腫瘤的代謝重編程。我們推測(cè)IF1可能作為NSCLC的潛在生物標(biāo)志物。
　　方法:
　　對(duì)149例NSCLC標(biāo)本進(jìn)行IF1免疫組化染色評(píng)分。根據(jù)評(píng)分結(jié)果結(jié)合病人信息進(jìn)行分析比較，統(tǒng)計(jì)分析IF1的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理參數(shù)之間的聯(lián)系，以及與患者預(yù)后和復(fù)發(fā)的關(guān)聯(lián)。
　　結(jié)果:
　　1.IF1在NSC

16、LC中的表達(dá)均顯著高于正常組織(p=0.034)，晚期患者(TNMⅢ/Ⅳ)的IF1表達(dá)水平顯著高于早期患者(TNMⅠ/Ⅱ)(p=0.033)。
　　2.在NSCLC組織中，IF1的表達(dá)與患者的TNM分期(p=0.032)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否(p=0.043)、吸煙與否(p=0.017)相關(guān)。TNM分期越晚，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，吸煙患者的IF1表達(dá)水平越高。
　　3.IF1高表達(dá)的NSCLC患者的生存時(shí)間明顯短于IF1低表達(dá)的NSCLC

17、患者(p=0.007)，且IF1的高表達(dá)與否可以作為NSCLC組患者獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)之一(HR=1.667，p=0.034)。在早期患者(TNMⅠ/Ⅱ)中IF1高表達(dá)的NSCLC患者的生存時(shí)間明顯短于IF1低表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌患者(p=0.042)，
　　4.IF1高表達(dá)的NSCLC患者的復(fù)發(fā)率明顯高于IF1低表達(dá)的NSCLC患者(p=0.003)。
　　結(jié)論:
　　IF1在NSCLC組織中的表達(dá)顯著高于正常肺組織，并且