LeGGPS2、AtCAO與AtHEMA1基因?qū)煵菽腿豕庑缘挠绊?pdf

1、弱光是目前制約設(shè)施生產(chǎn)的重要因素。研究表明弱光逆境不僅會(huì)引起植物葉綠素含量的變化，而且影響光合速率、光合產(chǎn)物的運(yùn)輸與分配，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，是國(guó)際上公認(rèn)的改良作物農(nóng)藝性狀的可行技術(shù)，且在提高作物光合速率方面已取得一定進(jìn)展，但弱光性狀是多基因控制的數(shù)量性狀，利用轉(zhuǎn)化色素合成關(guān)鍵基因提高作物光合速率及耐弱光性的報(bào)道迄今少見(jiàn)。
　　 本研究通過(guò)分析葉綠素和類胡蘿卜素的合成途徑，從擬南芥中克隆葉綠素合成

2、初期的關(guān)鍵基因谷氨酰-tRNA還原酶基因（AtHEMA1）、催化葉綠素b合成的關(guān)鍵基因葉綠素酸酯a氧化酶基因(AtCAO);并構(gòu)建了含番茄牻牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合成酶基因（LeGGPS2）的雙元表達(dá)載體pVCT2295，含AtCAO、AtHEMA1基因的雙元表達(dá)載體pVCT2299;通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將LeGGPS2基因、AtCAO與AtHEMA1基因轉(zhuǎn)入煙草。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行弱光處理后，分析導(dǎo)入基因?qū)煵莨夂仙睾?、光合速率、光?/p>

3、產(chǎn)物及植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響。
　　 主要結(jié)果如下:
　　 1.構(gòu)建了含LeGGPS2基因的雙元表達(dá)載體pVCT2295，并成功轉(zhuǎn)化煙草
　　 將從番茄品種Ailsa Craig（Solanum lycopersicon L.cv.Ailsa Craig）中克隆的LeGGPS2基因插入到載體pVCT2024中，構(gòu)建了含有LeGGPS2等基因的雙元載體pVCT2295，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草。對(duì)Kan抗性煙草植株進(jìn)行PC

4、R鑒定、熒光檢測(cè)，證明獲得了整合有Pnos-nptII、35S-LeGGPS2和35S-GFP外源基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株9株。
　　 2.LeGGPS2基因增強(qiáng)了弱光下煙草的光合性能，且增加了生物量積累
　　 弱光處理后，轉(zhuǎn)基因煙草株系TG1、TG2的類胡蘿卜素含量、葉綠素含量、光合速率均比野生煙草增加，達(dá)到了差異顯著性水平，可見(jiàn)轉(zhuǎn)入LeGGPS2基因可提高煙草弱光下的光合性能。另外，轉(zhuǎn)基因煙草的葉面積增長(zhǎng)量、單位葉面積重

5、量、總干重、根冠干重比，均比野生煙草高，證明轉(zhuǎn)入該基因可提高煙草的生物量積累并促進(jìn)其向根部的分配。
　　 3.克隆了AtCAO與AtHEMA1基因
　　 參照GenBank中公布的擬南芥葉綠素酸酯a加氧酶(AtCAO)、谷氨酰tRNA還原酶（AtHEMA1）基因序列，設(shè)計(jì)特異PCR引物，采用PrimStar HS DNA聚合酶從擬南芥(Arabidopsis thaliana L.Ecotype Columbia) gD

6、NA中擴(kuò)增目的片段，分別TA克隆進(jìn)T-載體pMD18-T和pMD19-T，構(gòu)成載體pVCT1263、pVCT1298。測(cè)序結(jié)果顯示與網(wǎng)上公布序列一致，表明成功克隆了AtCAO與AtHEMA1基因。
　　 4.成功獲得了分別含AtCAO基因、AtHEMA1基因的植物表達(dá)載體pVCT2296和pVCT2298
　　 將克隆的AtCAO基因插入到載體pVCT2100中，構(gòu)建含有npt(II)、AtCAO基因的表達(dá)載體pVCT2

7、296;將克隆的AtHEMA1基因插入到載體pVCT2101中，構(gòu)建含有npt(II)、AtHEMA1基因的表達(dá)載體pVCT2298;通過(guò)PCR和酶切鑒定，證明載體pVCT2296、pVCT2298構(gòu)建成功。
　　 5.獲得了含AtCAO與AtHEMA1基因的植物表達(dá)載體pVCT2299并成功轉(zhuǎn)化煙草
　　 將克隆的AtCAO基因插入到載體pVCT2298中，構(gòu)建了含有npt(II)、AtCAO、AtHEMA1基因的表達(dá)

8、載體pVCT2299，并經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)Kan抗性煙草植株進(jìn)行PCR鑒定，證明獲得了整合有npt(II)、AtCAO、AtHEMA1外源基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株24株。進(jìn)一步對(duì)選取的轉(zhuǎn)基因煙草株系TL1、TL2進(jìn)行Southern雜交，證實(shí)獲得了含單拷貝基因的煙草植株。
　　 6.轉(zhuǎn)AtCAO和AtHEMA1雙價(jià)基因不僅促進(jìn)煙草葉綠素b合成，且促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育，顯示出能增強(qiáng)煙草的耐弱光性
　　 弱光下轉(zhuǎn)基因煙草相比野生