甲嘧磺隆的微生物降解作用研究.pdf

1、利用生物修復(fù)法來(lái)降低環(huán)境中的農(nóng)藥是行之有效的措施之一,在諸多的農(nóng)藥生物修復(fù)方法中以微生物修復(fù)的研究和應(yīng)用最為廣泛,尤其微生物修復(fù)環(huán)境中長(zhǎng)殘效農(nóng)藥的研究較多。甲嘧磺隆是一種超高效、廣譜、持效期長(zhǎng)的磺酰脲類除草劑,在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用于林業(yè)及非耕地雜草的防除。甲嘧磺隆性質(zhì)穩(wěn)定、不易降解、在環(huán)境中持效期長(zhǎng),因此對(duì)敏感作物很容易造成藥害。甲嘧磺隆的水溶性較高,在土壤中的移動(dòng)性較強(qiáng),易造成對(duì)地下水的污染,因此,對(duì)甲嘧磺隆微生物降解作用的研究具有一

2、定的實(shí)踐意義。而關(guān)于甲嘧磺隆的微生物降解作用研究鮮見(jiàn)報(bào)道,本研究通過(guò)富集培養(yǎng)的方法從土壤和水中分離篩選出19株可降解甲嘧磺隆的微生物,對(duì)其中降解能力較強(qiáng)的JH2和JH3菌株進(jìn)行了降解特性及降解機(jī)理研究,主要研究結(jié)果如下:
　　 1.降解甲嘧磺隆微生物的篩選。利用富集培養(yǎng)技術(shù)從生產(chǎn)甲嘧磺隆農(nóng)藥廠的廢水中分離得到了19株能夠降解甲嘧磺隆的微生物,通過(guò)測(cè)定不同菌株對(duì)甲嘧磺隆的降解率發(fā)現(xiàn):供試菌株對(duì)低濃度甲嘧磺隆的降解率要顯著高于高濃度

3、的降解率,在培養(yǎng)基中甲嘧磺隆的含量為5mg·L-1時(shí),JH3菌株的降解率最高,為98.9％,其次是JH2菌株,降解率為95.3%。對(duì)其中降解作用較強(qiáng)的7個(gè)菌株進(jìn)行鑒定,其中JH3菌株為睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni);JH2菌株為食酸叢毛單胞菌(Delftia subsp);JH10菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis);JH6菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amylolique

4、faciens);SH3菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis);SH5菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis);SH4菌株為沙門氏菌(salmonella sp.)。
　　 2.JH2、JH3菌株的降解特性及降解機(jī)理研究。結(jié)果表明,JH2菌株的最適降解培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基Ⅲ,以甲嘧磺隆濃度為5mg·L-1時(shí)JH2、JH3菌株降解率最高;JH2菌株對(duì)甲嘧磺隆降解的適宜溫度為30℃,JH2菌株接種量為

5、1×108CFU·mL-1,轉(zhuǎn)速為150r·min-1,培養(yǎng)120h對(duì)甲嘧磺隆的降解率最高:JH3菌株對(duì)甲嘧磺隆降解的適宜溫度為35℃,接種量為1×107CFU·mL-1,轉(zhuǎn)速為150r·min-1,培養(yǎng)72 h時(shí)對(duì)甲嘧磺隆的降解率最高;通過(guò)對(duì)JH2、JH3菌株進(jìn)行作用機(jī)理研究,兩菌株降解產(chǎn)物的特征峰基本相同,降解產(chǎn)物的主要碎片離子為m/z198、分子式為C8H7O4S的化合物,其紫外檢測(cè)的保留時(shí)間為3.0min,推斷甲嘧磺隆結(jié)構(gòu)式中的

6、另一半結(jié)構(gòu)可能降解為鏈狀烷烴,沒(méi)有紫外吸收,也不能離子化,因此沒(méi)有特征峰。以此判斷JH2、JH3對(duì)甲嘧磺隆降解的作用位點(diǎn)在S-N鍵。
　　 3.JH2、JH3菌株降解酶活性研究。通過(guò)JH2、JH3菌株對(duì)甲嘧磺隆降解酶定域表達(dá)試驗(yàn)表明,兩菌株的胞內(nèi)酶和胞外酶均有活性,降解甲嘧磺隆的關(guān)鍵酶都主要是胞外酶且降解酶誘導(dǎo)表達(dá)。在LB液體培養(yǎng)基中,當(dāng)甲嘧磺隆濃度為5mg·L-1、接種量為2.3×108CFU·mL-1、初始pH值為8.0、溫

7、度30℃、轉(zhuǎn)速為150r·min-1、培養(yǎng)時(shí)間120 h時(shí)JH2菌株胞外粗酶的酶比活最高達(dá)到85.8U·mg-1;其酶促反應(yīng)體系的甲嘧磺隆最適濃度為5mg·L-1、溫度30℃、pH值為8.0時(shí)胞外酶對(duì)甲嘧磺隆的降解率最大為86.9%。在LB液體培養(yǎng)基中,當(dāng)甲嘧磺隆濃度為5mg·L-1、接種量為2.3×107CFU·mL-1、初始pH值為9.0、溫度35℃、轉(zhuǎn)速為150r·min-1、培養(yǎng)時(shí)間72h時(shí)JH3菌株胞外粗酶的酶比活最高達(dá)到88

8、.4U·mg-1;酶促反應(yīng)體系的甲嘧磺隆最適濃度為5mg·L-1、溫度35℃、pH值為9.0時(shí)胞外酶對(duì)甲嘧磺隆的降解率最大為91.3%。兩菌株甲嘧磺隆降解酶在25℃～45℃范圍內(nèi)熱穩(wěn)定性較好,pU值為7～9堿性條件下能夠保持較高降解活性。
　　 4.JH2、JH3菌株降解甲嘧磺隆活性酶的純化。胞外粗蛋白經(jīng)過(guò)DEAE SepHaroseFast Flow陰離子交換柱分離,在280nm下JH2菌株得到5個(gè)蛋白吸收峰,降解圈法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)

9、3個(gè)洗脫峰P1-1、P1-3、P1-5均有降解活性;JH3菌株得到2個(gè)蛋白吸收峰,降解圈法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)僅P2-2洗脫峰具有降解活性;SDS-PAGE電泳檢測(cè)P1-1、P1-3、P1-5和P2-2的分子量分別是43kDa、32kDa、15kDa和46kDa。將甲嘧磺隆降解酶P1-1、P1-3、P1-5和P2-2利用生物質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定了氨基酸序列,得到4種降解酶分別為:信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組氨酸蛋白激酶、預(yù)苯酸脫氫酶、未知蛋白和糖基轉(zhuǎn)移酶。根據(jù)得到的編碼氨基

10、酸的基因序列設(shè)計(jì)合成了簡(jiǎn)并引物,通過(guò)PCR分別從JH2、JH3菌株基因組中克隆出甲嘧磺隆降解酶基因G1-1、G1-3、G1-5和G2-2,編碼基因全長(zhǎng)分別是1191 bp、886 bp、415 bp、1274 bp;G1-1、G1-3、G1-5和G2-2分別與載體PMD19-Vector連接轉(zhuǎn)入大腸桿菌,篩選得到陽(yáng)性克隆并測(cè)序,通過(guò)Blast軟件分析,所得結(jié)果與已測(cè)序得到的編碼氨基酸的基因序列基本吻合。
　　 5.降解甲嘧磺隆微

11、生物菌劑加工及應(yīng)用的研究。本論文初步研制出JH2、JH3菌株的水劑和顆粒劑配方,篩選出了對(duì)甲嘧磺隆敏感的植物是小麥,生物活性測(cè)定甲嘧磺隆對(duì)小麥的IC50值為0.014mg·kg-1。在分別使用JH2和JH3菌株水劑20 d和15 d后能將土壤中甲嘧磺隆濃度為5mg·kg以和1mg·kg-1的殘留降解為對(duì)小麥無(wú)明顯藥害水平,通過(guò)HPLC檢測(cè)處理后土壤中的甲嘧磺隆發(fā)現(xiàn),土壤中甲嘧磺隆殘留量小于0.0077mg·kg-1,降解率達(dá)到了99%以