針對LOX-1的吡咯-咪唑聚酰胺藥物支架對大鼠腹主動脈支架內再狹窄的影響.pdf

1、冠脈藥物洗脫支架(DES)部分解決了支架植入后的再狹窄問題，但也凸顯了局部內皮化延遲及晚期血栓形成的風險。支架內再狹窄(ISR)具有高度局部化的特性，從而使局部的基因沉默治療成為可能。對再狹窄相關致病基因的特異性沉默可以在解決再狹窄問題的同時避免局部內皮化的延遲。吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)是一種能使特定基因沉默的化合物，與傳統(tǒng)基因沉默技術相比，它能夠不借助任何特殊載體進入細胞核，同時，由于其分子量小、結構穩(wěn)定、對核酸酶耐受、細胞攝取率及

2、生物利用度高、脂溶性強，因此更適合作為靶點基因沉默藥物用于支架系統(tǒng)。引起再狹窄的最主要病理過程是血管平滑肌細胞(VSMCs)在血管損傷后的增殖及由中膜向外膜遷移，從而導致的新生內膜(NIH)形成。凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體(LOX-1)的激活及其與氧化應激反應之間的正反饋在VSMCs的增殖和遷移及NIH生成的過程中發(fā)揮著重要的作用。因此，本研究建立離體及在體模型，著重探討針對LOX-1基因啟動子的PIP能否特異性的抑制LOX-1基因

3、的表達，從而阻斷LOX-1與氧化應激之間的正反饋，達到抑制VSMCs增殖、遷移和抑制支架內再狹窄的目的，為開發(fā)新一代的藥物支架提供理論依據(jù)。研究主要由2部分組成：①合成能特異性沉默LOX-1基因的PIP化合物，并觀察其對ox-LDL介導的VSMCs的增殖和遷移的影響；②制備能特異性沉默LOX-1的PIP藥物支架并將其植入大鼠腹主動脈內，觀察其對損傷血管局部支架內再狹窄及再內皮化的影響。
　　 一、針對LOX-1的PIP對ox-L

4、DL介導的VSMC增殖和遷移的影響
　　 目的：合成能特異性沉默LOX-1基因的PIP，觀察PIP對ox-LDL介導的VSMCs增殖和遷移的影響。
　　 方法：構建大鼠LOX-1基因啟動子的報告基因質粒并將其轉染入HEK293細胞，確定LOX-1基因AP-1增強子位點，根據(jù)吡咯-咪唑與DNA小溝的堿基配對原則確定能特異性沉默LOX-1基因的PIP結構式并合成PIP化合物。體外培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMCs并行α-肌動蛋白(α

5、-SMA)特異性免疫細胞化學染色鑒定。細胞實驗共分為4組：Control組，Control+ox-LDL(10ug/ml)組，Control+ox-LDL+PIP (10-6mmol/L)組，Control+ox-LDL組+mismatch PIP (10-6mmol/L)組。通過Westblot法測定各組細胞LOX-1表達的情況，通過細胞計數(shù)法、噻唑藍比色(MTT)法測定各組細胞增殖的情況，通過Transwell細胞遷移實驗觀察各組細

6、胞的遷移情況。
　　 結果：使用膠原酶消化法培養(yǎng)原代VSMCs，細胞呈典型的“峰-谷”狀生長，經α-SMA特異性免疫細胞化學染色后，VMSCs胞漿呈陽性反應。Ox-LDL(10μg/ml)能夠誘導VSMCs的細胞計數(shù)增多，MTT代謝率增高及細胞遷移增多(P<0.01)。PIP (10-6mmol/L)能夠明顯降低ox-LDL刺激引起的VSMCs LOX-1表達增高(P<0.01)，同時，PIP (10-6mmol/L)能夠顯著抑

7、制VSMCs的細胞計數(shù)增多、MTT代謝率增高及細胞遷移增多(P<0.01)。而mismatch PIP則無此效果。
　　 結論：針對LOX-1基因AP-1啟動子位點的PIP能夠特異性的沉默LOX-1基因，并明顯減低ox-LDL刺激引起的VSMCs增殖和遷移。能特異性沉默LOX-1基因的PIP應用于藥物支架系統(tǒng)預防支架植入后再狹窄的作用值得進一步探討。
　　 二、化學基因沉默LOX-1藥物支架對大鼠腹主動脈支架內再狹窄及再

8、內皮化的影響
　　 目的：制備能沉默LOX-1基因的PIP藥物支架，并將其植入大鼠腹主動脈內，觀察其對損傷血管局部支架內再狹窄及再內皮化的影響，并探討相應機制。
　　 方法：按照1.0μg/mm2的載藥量構建2.0×9.0mm PIP藥物支架。使用高效液相色譜法(HPLC)測定支架的體內外藥物釋放動力學。建立大鼠腹主動脈內植入藥物支架的動物模型，實驗共分為4組：假手術組(n=10)，裸支架組(n=10)，PIP藥物支架組

9、(n=10)，mismatch PIP藥物支架組(n=10)。每組各3只動物于支架植入14天后處死，留取少量標本行HPLC檢測后，將含支架的血管行掃描電鏡檢查觀察各組的支架表面內皮化情況。另外每組各6只動物與支架植入28天后處死，留取少量標本行HPLC檢測后，將標本分為3部分，一部分-80°C保存，使用Real-time PCR及Westblot法檢測各組的LOX-1、NADPH氧化酶p22phox亞單位、NADPH氧化酶p47phox

10、亞單位的mRNA及蛋白表達情況，一部分組織風干后勻漿，使用硫代巴比妥酸反應產物(TBARS)法測定各組的丙二醛(MDA)水平。最后一部分部分組織包埋入甲基丙烯酸甲酯中，切取5μm的切片，然后H-E染色后于顯微鏡下觀察并計算新生內膜面積、新生內膜厚度、損傷指數(shù)及炎癥指數(shù)。
　　 結果：PIP藥物支架在24h內釋放超過90％，能夠成功建立大鼠腹主動脈植入藥物支架的動物模型。支架植入14d后，局部血管組織中有少量PIP藥物留存，掃描電

11、鏡顯示，裸支架、PIP藥物支架、mismatch PIP藥物支架表面均具有較高的內皮化程度。支架植入28d后，局部血管組織中仍有微量PIP藥物留存；與對照組相比，裸支架組損傷血管局部的LOX-1、NADPH氧化酶p22phox亞單位、NADPH氧化酶p47phox亞單位的mRNA及蛋白表達均明顯升高 (P<0.01)，MDA水平明顯升高(P<0.01)。PIP藥物支架能夠降低損傷血管局部的LOX-1、NADPH氧化酶p22phox亞單位

12、、NADPH氧化酶p22phox亞單位的mRNA、蛋白表達及MDA水平(P<0.01)。與裸支架組相比，PIP組支架內新生內膜面積明顯降低(P<0.05)，再狹窄程度明顯降低(P<0.05)；而mismatch PIP藥物支架的上述指標與裸支架相比均無明顯差異(P>0.05)。此外，裸支架、PIP藥物支架、mismatch PIP藥物支架均具有相似的損傷指數(shù)及較低的炎癥評分。
　　 結論：以DMSO為溶劑的PIP藥物支架不具備良