番茄斑萎病毒和番茄環(huán)紋斑點病毒細胞病理學及其運動蛋白的研究.pdf

1、番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)侵染植物，寄主范圍廣泛，危害嚴重，近年來在我國陸續(xù)有許多新種或新分離物報道。其中番茄環(huán)紋斑點病毒(Tomatozonate spot virus，TZSV)是2008年報道的該屬新種，與該屬代表種番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）基因組結構相似，但是同源性較低。為了研究大顆粒病毒的胞間運動機理，我們對兩種病毒的細胞病理學及胞間運動機理開展了研究。
　　

2、 通過透射電子顯微鏡觀察常溫固定包埋和高壓冷凍固定包埋兩種方法處理的TSWV、TZSV感病植物葉片發(fā)現(xiàn)，兩種病毒的形態(tài)及細胞病理變化大致相似，但也存在差異。與TSWV相比，TZSV對細胞器的影響更大。TZSV侵染的葉片在葉綠體處也能像TSWV一樣產(chǎn)生囊泡，部分葉綠體的囊泡幾乎占據(jù)整個葉綠體，片層結構破壞更加嚴重。在線粒體中也能夠產(chǎn)生與葉綠體內(nèi)相似的囊泡結構，這種現(xiàn)象在TSWV侵染的葉片內(nèi)難以觀察到，相比之下，TSWV侵染的葉片線粒體保

3、存的更加完好。該結果也可以在一定程度上說明為什么在田間狀態(tài)下，TZSV對作物造成的危害更加嚴重。
　　 為了研究TSWV、TZSV運動蛋白NSm的細胞定位。將兩種病毒的NSm基因融合GFP后構建到植物雙元表達載體pCHF3中，農(nóng)桿菌介導浸潤本氏煙葉片，同時將融合GFP的NSm基因利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達體系轉(zhuǎn)染昆蟲Tn細胞。在激光共聚焦顯微鏡下觀察NSm-GFP在煙草表皮細胞中和昆蟲Tn細胞中的定位情況。觀察發(fā)現(xiàn)與單

4、獨表達GFP在細胞壁周圍和細胞核處均勻分布不同，TSWV、TZSV NSm-GFP融合蛋白會在植物細胞內(nèi)擴散，能夠在細胞壁邊緣定位，并且在胞間連絲處呈不連續(xù)的綠色熒光小點，偶爾成對出現(xiàn)在相鄰的兩個細胞之間。TSWV的GFP-NSm融合蛋白能夠在昆蟲Tn細胞表面誘導產(chǎn)生數(shù)量眾多的管狀結構并向外延伸，長度遠長于在胞間連絲處形成的NSm蛋白小管。TZSV的GFP-NSm融合蛋白也能在昆蟲Tn細胞內(nèi)表達，但是不能產(chǎn)生管狀結構，主要分布在細胞質(zhì)內(nèi)

5、，成團塊狀聚集;該蛋白也能在細胞核表面定位，呈網(wǎng)刺狀，圍繞著細胞核形成圓環(huán)形。
　　 為了進一步直觀研究兩種病毒的運動蛋白在亞細胞結構內(nèi)的確切定位分布情況，利用大腸桿菌系統(tǒng)pET系列載體表達了TSWV、TZSV的NSm基因，以Ni2+-NTA agarose親和柱分別純化了這兩個蛋白與His組氨酸的融合蛋白并制備了相應的多克隆抗體。其中，TSWV NSm蛋白制備的多克隆抗血清進行Westem blot結果顯示，抗血清對該蛋白具有