四種石杉科植物中產(chǎn)生石杉堿甲的內(nèi)生真菌的分離、鑒定和其石杉堿甲含量的測定.pdf

1、癡呆是由于腦功能障礙而產(chǎn)生的獲得性智能損害綜合癥。通常引起癡呆的原因包括變性病性和非變性病性,前者主要包括阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)和額顳癡呆等;后者主要包括血管性癡呆、感染性癡呆、代謝性和中毒性腦病。其中以阿爾茨海默型癡呆和血管性癡呆。
　　 老年癡呆,心、腦血管疾病和惡性腫瘤已成為老年人致殘、致死的四大疾病。而老年癡呆癥已成為常見的死亡原因的第四位。20世紀(jì)80年代初,我國科學(xué)家首先從中國民

2、間草藥“千層塔”中分離到石杉堿甲(Huperzine A),經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)證明它是一種低毒、高效、可逆和高選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑,有強(qiáng)效、高選擇性的抗乙酰膽堿酯酶活性及提高學(xué)習(xí)和改善老年人記憶功能的作用。目前已有新藥上市,廣泛用于阿爾茨海默病和血管性癡呆的治療。
　　 到目前為止,石杉堿甲僅發(fā)現(xiàn)存在于石杉科植物中。石杉科植物是現(xiàn)存的最古老的蕨類植物類群之一,曾繁盛于古生代,后隨種子植物的崛起而大多滅絕?，F(xiàn)殘存的種類,絕大部分為腐

3、生或寄生,多分布于人跡罕至的原始森林中,且生長緩慢、植株矮小,對空氣、光照、溫度、濕度等因素要求苛刻。近年來,隨著石杉堿甲被分離并廣泛應(yīng)用于臨床,掀起了研究開發(fā)的熱潮,對其需求也越來越大,人們便開始對石杉科植物的掠奪式開發(fā),再加上其它因素如生態(tài)環(huán)境惡化等的威脅,使其資源越來越匱乏。目前盡管報道了多種石杉堿甲的全合成方法,但是價格昂貴,步驟繁瑣,基本沒有實(shí)用價值。
　　 石杉科植物中存在多種內(nèi)生真菌,內(nèi)生真菌種類繁多,在寄主植物組

4、織內(nèi)部的生長發(fā)育過程中,其代謝產(chǎn)物對植物體本身有著各種各樣的影響。
　　 本文選取了四種石杉科植物并對其的內(nèi)生真菌進(jìn)行研究,得到產(chǎn)生石杉堿甲的內(nèi)生真菌,根據(jù)顯微形態(tài)對菌種進(jìn)行了初步鑒定,改進(jìn)篩選內(nèi)生真菌的培養(yǎng)條件,并建立了HPLC方法來檢測內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中的石杉堿甲的含量。另外,本文還使用組織培養(yǎng)方法來培養(yǎng)石杉科植物。
　　 1.四種石杉科植物的內(nèi)生真菌的培養(yǎng)和分離
　　 選用四種含有石杉堿甲的石杉科植物:蛇足

5、石杉,長柄石杉,伏貼石杉,柳杉葉馬尾杉,對其進(jìn)行滅菌等處理經(jīng)培養(yǎng)得到內(nèi)生真菌,采用平板劃線法進(jìn)行菌種分離純化,并對真菌進(jìn)行觀察,拍照記錄。反復(fù)實(shí)驗(yàn)中得到適合篩選內(nèi)生真菌的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度為28℃。
　　 2.樣品處理和石杉堿甲含量測定方法
　　 利用得到的內(nèi)生真菌的樣品和石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定了HPLC的測定方法,發(fā)現(xiàn)了2株內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生石杉堿甲,并測定了真菌樣品中石杉堿甲含量。
　　 3.

6、內(nèi)生真菌菌種鑒定
　　 觀察并記錄內(nèi)生菌落培養(yǎng)特征和顯微形態(tài)特征,對照有關(guān)資料確定真菌的分類學(xué)地位。這兩個菌株分別為芽胞菌屬(Blastomyces Cost.ex Roll.),葡萄孢屬(BotrytisPers.ex Fr.)。
　　 4.石杉堿甲檢測條件優(yōu)化
　　 比較了提取液經(jīng)堿化再用有機(jī)溶劑萃取除雜質(zhì)和直接測定提取液的效果。考察了超聲提取時間和不同提取溶劑對提取效果的影響;還考察了不同紫外檢測波長對檢測