蛇足石杉的離體培養(yǎng)及內(nèi)生真菌的分離與鑒定.pdf

1、蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb)Trev.)，系石杉科(Huperiaceae)石杉屬(Huperzia)多年生蕨類植物，民間常用于治療癰癤、跌打損傷、腫毒等癥。蛇足石杉內(nèi)含石杉堿甲，為可逆性膽堿酯酶抑制劑，對于預防和治療老年性癡呆、記憶力減退和重癥肌無力具有顯著的療效。目前國際上已將石杉堿甲列為第二代乙酰膽堿酯酶抑制劑之一，是治療老年性癡呆(AD)的特效藥。本研究以野生蛇足石杉為材料，初步建立蛇足石杉離體培養(yǎng)再

2、生體系，為以后的離體快繁研究提供指導;同時從外植體中分離出了3種內(nèi)生真菌，測定其ITS序列進行分子鑒定;定性檢測了3種內(nèi)生真菌是否產(chǎn)石杉堿甲，并對其抗植物病原真菌活性進行了檢測，為進一步研究提供參考。主要研究結果如下：
　　1.蛇足石杉離體培養(yǎng)研究
　　(1)獲取無菌外植體的最佳滅菌條件。外植體洗凈后在0.01mol·L-1HCl+5％NaClO+0.0024mol·L-1檸檬酸配成的溶液中浸泡1min，再依次浸入70％乙醇

3、中1min，5％ NaClO中15min，7％H2O2中10min可得到最佳表面滅菌效果，40％的外植體沒有微生物污染跡象;再經(jīng)0.5mg·L-1孔雀石綠+50，100mg·L-1 AAS聯(lián)合使用時，可獲得最佳的內(nèi)生菌滅菌效果，20％的外植體無感染。
　　(2)外植體繼代培養(yǎng)后可產(chǎn)生不定芽。無菌外植體培養(yǎng)約90 d后，開始出現(xiàn)生長變化，主要有兩種變化類型:一種為外植體本身沒有出現(xiàn)明顯的生長，但靠近莖基部的同一節(jié)點處開始分化出新芽;

4、另一種變化為外植體有少量的生長，且在莖的上部形成多個小不定芽，不定芽能剝離母株獨立生長，5mm以上的不定芽接種到1/2MS+30g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上，存活率可達90％，120d后生長為2-3cm的幼苗。
　　(3)無菌苗誘導產(chǎn)生不定根。對無菌苗主枝的頂芽以及主枝上產(chǎn)生的不定芽進行了生根誘導，在基本培養(yǎng)基中添加IBA1.0mg·L-1+2.0mg·L-1谷氨酰胺，對兩種類型的無菌苗的生根有明顯的促進作用，其中在1/3MS基本培養(yǎng)

5、基上添加的效果最好，不定芽的生根率可達90％，頂芽的生根率也可達30％。
　　2.內(nèi)生真菌研究
　　(1)從蛇足石杉中分離出3種內(nèi)生真菌，測定ITS序列對其進行鑒定。3種內(nèi)生真菌，分別命名為NSZJ-Ⅰ，NSZJ-Ⅱ，NSZJ-Ⅲ，經(jīng)鑒定NSZJ-Ⅰ屬座囊菌綱(Dothideomycetidae)，煤炱目(Capnodiales)，小球殼科(Mycosphaerellaceae),Pseudocercosporella屬。N

6、SZJ-Ⅱ在Genebank中BLAST結果相似序列較少，初步鑒定屬于座囊菌綱(Dothideomycetidae)，煤炱目(Capnodiales)。NSZJ-Ⅲ屬于座囊菌綱(Dothideomycetes)，座囊菌目(Dothideales),Hortaea屬。
　　(2)3種內(nèi)生真菌產(chǎn)石杉堿甲的定性檢測。經(jīng)薄層色譜法(TLC)測定，3種內(nèi)生真菌均不產(chǎn)石杉堿甲。
　　(3)3種內(nèi)生真菌抗植物病原真菌活性檢測。取油茶葉枯病

7、原真菌（小孢擬盤多毛孢菌Pestalotiopsis microspora）、油茶炭疽病原真菌(膠孢炭疽菌Calletotrichum gloeosporioides)、油茶軟腐病原真菌(傘座孢菌Agaricodochiumcamellia)、核桃腐爛病原真菌(殼囊孢菌Cytospora juglandis)四種植物病原真菌為實驗菌，經(jīng)測定，NSZJ-Ⅰ對四種植物病原真菌抗菌活性較弱;NSZJ-Ⅱ?qū)τ筒枞~枯病原真菌有較好的抗菌活性，抑制