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文檔簡(jiǎn)介
1、在人類(lèi)輔助生殖技術(shù)體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET)和卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)的過(guò)程中,有一些受精卵不能成功的進(jìn)行卵裂。在少數(shù)患者中,她們的大部分受精卵都不能成功的完成第一次細(xì)胞分裂。目前,其原因和機(jī)制尚不清楚。因此,非常有必要對(duì)調(diào)控受精卵第一次細(xì)胞分裂的主要因素進(jìn)行深入的研究,以期為
2、解決這個(gè)臨床問(wèn)題提供理論基礎(chǔ)和新的思路和方法。
第一部分 PLK1在受精卵第一次分裂過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)
目的:探討PLK1在小鼠受精卵第一次分裂過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及其與細(xì)胞周期的時(shí)間關(guān)系。
方法:用孕馬血清對(duì)小鼠進(jìn)行促排卵,48h后注射HCG,并與雄鼠同籠誘導(dǎo)體內(nèi)受精。采用Western blot方法檢測(cè)PLK1在注射HCG后16h、24h、28h、32h和36h的小鼠受精卵中的表達(dá)情況。并分析PL
3、K1在受精卵中表達(dá)的變化與受精卵第一次分裂時(shí)間進(jìn)程的關(guān)系。
結(jié)果:從注射HCG后16h到36h,PLK1的表達(dá)量是不斷增加的。注射HCG后32h-36h,PLK1在受精卵中的表達(dá)量達(dá)到最大,并且顯著的高于其他各組(16h、24h和28h,P=0.000)。這個(gè)時(shí)間正好與小鼠受精卵第一次分裂的M期相吻合。
結(jié)論:PLK1的表達(dá)在小鼠受精卵第一次分裂的M期達(dá)到最高水平,可能在此過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
4、 第二部分 去除透明帶對(duì)體外培養(yǎng)小鼠受精卵第一次卵裂的影響
目的:探討去除透明帶對(duì)體外培養(yǎng)小鼠受精卵第一次卵裂率的影響。排除去除透明帶對(duì)小鼠受精卵首次分裂的影響,為下一部分實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
方法:用孕馬血清對(duì)小鼠進(jìn)行促排卵,48h后注射HCG,并與雄鼠同籠誘導(dǎo)體內(nèi)受精,取受精卵。將受精卵分為去透明帶組和不去透明帶組,體外培養(yǎng),觀察兩組受精卵分裂為2細(xì)胞胚胎的卵裂率。
結(jié)果:去透明帶組的卵裂率為
5、64.12%±1.61%,不去透明帶組的卵裂率為63.06%±1.48%。兩組之間沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
結(jié)論:在體外培養(yǎng)的環(huán)境下,去除透明帶對(duì)受精卵的早期發(fā)育沒(méi)有影響。沒(méi)有透明帶的受精卵也能夠正常的進(jìn)行分裂。
第三部分降調(diào)PLK1的表達(dá)后對(duì)小鼠受精卵第一次卵裂率的影響
目的:驗(yàn)證PLK1siRNA對(duì)小鼠受精卵PLK1降調(diào)的作用,建立PLK1缺乏的受精卵模型。并以
6、此為基礎(chǔ),探討缺乏PLK1對(duì)小鼠受精卵第一次卵裂的影響。
方法:采用RNA干擾(siRNA)的方法降調(diào)PLK1在小鼠受精卵中的表達(dá),并用Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。實(shí)驗(yàn)分為四組:PLK1siRNA、siRNA control、mock transfection和only ZP removal。轉(zhuǎn)染成功后,將缺乏PLK1的受精卵體外培養(yǎng),統(tǒng)計(jì)第一次卵裂率。
結(jié)果:PLK1siRNA組的PLK1含量顯著
7、低于其他三組(P=0.000)。PLK1siRNA組的首次卵裂率也顯著的低于其他三組(P=0.000)。
結(jié)論:siRNA能夠有效的降低PLK1在小鼠受精卵中的表達(dá)。缺乏PLK1的受精卵不能成功的進(jìn)行第一次卵裂,PLK1在受精卵的第一次分裂過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。
第四部分不卵裂受精卵微管蛋白/紡錘體和核/染色體形態(tài)的觀察
目的:觀察不卵裂受精卵中微管蛋白/紡錘體和核/染色體的形態(tài),探討染色體和
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