納米生物探針的制備及DNA損傷檢測應用.pdf

1、DNA是機體生命活動最重要的遺傳物質(zhì)，DNA損傷則是生物體內(nèi)經(jīng)常發(fā)生的事件，損傷的類型主要包括DNA氧化和堿基修飾。DNA甲基化歸屬于DNA堿基修飾這一大類，它對DNA造成的損傷雖然不改變DNA序列，但能導致DNA中共價鍵的改變，使可遺傳的基因表達發(fā)生改變，從而影響基因的正常轉(zhuǎn)錄和翻譯，影響儲存遺傳信息的載體。DNA甲基化是發(fā)現(xiàn)最早的、最基本的，也是研究最多的表觀遺傳學機制。正常細胞功能的行使有賴于表觀遺傳的穩(wěn)態(tài)的維持，而大量研究證明D

2、NA不正常的甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達，影響基因的活性和功能，而這些表觀遺傳的穩(wěn)態(tài)的打亂是與多種復雜疾病以及各類癌癥的發(fā)病密切相關(guān)的。特別是癌癥，其發(fā)生過程中癌細胞基因組局部區(qū)域的超甲基化和整體的欠甲基化是其典型的特征。超甲基化體現(xiàn)在抑癌基因的啟動子區(qū)被異常甲基化;而重復序列以及癌基因的啟動子區(qū)的甲基化程度減小、基因組遺傳不穩(wěn)定性的增加會直接導致整體的欠甲基化。因

3、此，建立快速、靈敏、低成本的檢測方法來檢測DNA甲基化和甲基轉(zhuǎn)移酶活性，對各類疾病尤其癌癥進行早期診斷和治療，對于提高疾病患者的生存率，具有十分重要的意義。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴富含胞嘧啶(G)堿基的DNA與捕獲DNA和靶向DNA在金電極上形成特異性探針，通過G4聯(lián)體和血紅素構(gòu)建的HRP模擬酶來催化誘導苯胺聚合生成聚苯胺，從而產(chǎn)生較強的電化學信號。但加入核酸酶后，探針中含有特異序列的雙鏈DNA就會被識別、切割，并進一步被消化

4、，富含G堿基的DNA從電極上脫落。則無法通過G4聯(lián)體來構(gòu)建HRP模擬酶，沒有酶的催化作用，后續(xù)苯胺的聚合不能進行，從而導致電化學信號消失。當雙鏈DNA中的CG位點被甲基化后，會有效抑制核酸酶的識別、切割和消化，則HRP模擬酶催化生成聚苯胺，從而保留了電化學信號。采集到的電化學信號與DNA甲基化程度和甲基轉(zhuǎn)移酶活性直接相關(guān)，以此為基礎(chǔ)構(gòu)建的生物傳感器對M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶活性的檢測限為0.12 UmL-1，能對DNA甲基化進行特異性檢測

5、，還可用于DNA甲基化抑制劑的相關(guān)檢測。⑵通過與含有5'-CCGG-3'特定序列的DNA雜交，將探針DNA修飾的金納米粒子組裝在金電極表面，探針DNA可以引發(fā)兩個發(fā)夾DNA交替進行模擬-雜交鏈反應，從而在電極上形成眾多的超長雙鏈DNA，促使電化學指示劑六銨合釕的大量嵌插，從而產(chǎn)生強烈的電化學信號。但未經(jīng)甲基化的5'-CCGG-3'序列會被特定的核酸酶識別和剪切，從電極上脫落，模擬-雜交鏈反應就不會被引發(fā)，故沒有電化學響應;反之，DNA的

6、甲基化會保護該序列不被核酸酶切割，則依然可以采集到強烈的電化學信號。由于金納米粒子和模擬-雜交鏈反應的協(xié)同作用，使得雜交鏈反應繼續(xù)進行，從而電化學信號大大增強，所以本法對M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶的檢測限降至0.03 U mL-1，顯著提升了傳感器的靈敏度，并且方法的特異性和重復性都很好，能用于甲基化抑制劑的檢測。⑶利用石墨烯材料表面豐富的親水基團和獨特的二維結(jié)構(gòu)，合成了還原型石墨烯和殼聚糖的納米復合物，并用其在電極上共價結(jié)合乙酰膽堿酯酶構(gòu)