弱光探測(cè)器的超分辨定位成像性能研究.pdf

1、近年來，基于單分子定位的超分辨定位顯微成像技術(shù)迅猛發(fā)展，已經(jīng)成為人們?cè)诩{米尺度研究微觀生物世界的重要工具，甚至有可能成為當(dāng)前全球興起的腦研究計(jì)劃的關(guān)鍵技術(shù)支持。在超分辨定位成像過程中，熒光探針、弱光探測(cè)器和單分子定位算法是影響成像質(zhì)量的三大因素。弱光探測(cè)器作為其中承上啟下的關(guān)鍵部件，將單分子信號(hào)特點(diǎn)準(zhǔn)確地記錄下來，為后續(xù)定位算法提供高質(zhì)量的圖像，是最終獲取高分辨率圖像的基礎(chǔ)和保障。因此，根據(jù)單分子信號(hào)特點(diǎn)選擇合適的弱光探測(cè)器以獲得最佳成

2、像分辨率將會(huì)非常重要，尤其是在一些超精細(xì)結(jié)構(gòu)的研究中，分辨率的微小提升都有著重大意義。但是目前，還沒有人在嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量控制和完善的數(shù)據(jù)分析方法下量化弱光探測(cè)器的超分辨定位成像性能。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴量化弱光探測(cè)器超分辨定位成像性能的理論分析。通過分析熒光探針、弱光探測(cè)器、單分子定位算法之間的相互聯(lián)系，明確了比較弱光探測(cè)器性能需要全面綜合考慮單分子信號(hào)特點(diǎn)和定位算法的影響。并在此基礎(chǔ)上指出了之前相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中存在的不

3、足，同時(shí)完善了探測(cè)器噪聲依賴的定位算法，為后續(xù)研究奠定實(shí)驗(yàn)和分析方法基礎(chǔ)。⑵量化弱光探測(cè)器超分辨定位成像性能的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。對(duì)用于探測(cè)器性能比較的光學(xué)系統(tǒng)做了針對(duì)性改進(jìn)，以確保嚴(yán)格的數(shù)據(jù)質(zhì)量控制。首先將探測(cè)信號(hào)平均分成兩條光路，并通過二次放大倍率匹配成像面像素尺寸都為100 nm，確保EMCCD和sCMOS能夠在幾乎相同的成像條件下進(jìn)行同步采集；隨后對(duì)成像系統(tǒng)的穩(wěn)定性和單分子成像性能進(jìn)行表征，表明光學(xué)系統(tǒng)具備高質(zhì)量單分子成像的能力，為弱光探

4、測(cè)器的超分辨定位成像性能研究提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)保障。⑶直觀、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)亓炕豕馓綔y(cè)器超分辨定位成像性能。結(jié)合不同噪聲模型的單分子定位算法，我們以單分子實(shí)驗(yàn)定位精度為主要指標(biāo)，在常規(guī)的超分辨定位成像實(shí)驗(yàn)條件和信號(hào)強(qiáng)度下對(duì)EMCCD和sCMOS的成像性能進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：若使用傳統(tǒng)的極大似然法，EMCCD因其具有更低的讀出噪聲，在低背景、弱信號(hào)工作區(qū)間有比較明顯優(yōu)勢(shì)；然而隨著信號(hào)強(qiáng)度，尤其是背景強(qiáng)度的增加，EMCCD成像性能受到電子倍增額外噪聲

5、的影響，其成像性能降低，并逐漸被sCMOS超越；另一方面，對(duì)于EMCCD相機(jī)，噪聲模型依賴的極大似然法提供的定位精度與傳統(tǒng)極大似然法相差不多，或者僅稍優(yōu)于傳統(tǒng)極大似然法；但對(duì)于sCMOS相機(jī)，噪聲模型依賴的極大似然法在信號(hào)水平相對(duì)較低時(shí)（對(duì)應(yīng)于大多數(shù)熒光蛋白的信號(hào)強(qiáng)度范圍），獲得的定位精度明顯優(yōu)于傳統(tǒng)極大似然法；通過這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，sCMOS相機(jī)在探測(cè)器噪聲模型依賴的定位算法支持下，即使信號(hào)較弱時(shí)也能獲得與 EMCCD相似的成像性