用EPR技術(shù)測(cè)量蛋白質(zhì)分子內(nèi)選定位點(diǎn)之間的距離.pdf

1、生物大分子（如蛋白質(zhì)）的結(jié)構(gòu)與功能研究是現(xiàn)代生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域。定點(diǎn)自旋標(biāo)記結(jié)合電子順磁共振(Site-Directed Spin Labeling ElectronParamagnetic Resonance，SDSL-EPR)技術(shù)是目前可以在生理環(huán)境下研究蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的主要方法之一。SDSL-EPR技術(shù)利用SDSL技術(shù)在生物分子內(nèi)的目的位點(diǎn)選擇性地標(biāo)記上含有未偶自旋的氮氧自由基，再通過(guò)EPR技術(shù)測(cè)量未偶自旋的波譜狀態(tài)，通過(guò)波譜解

2、析，可以獲得標(biāo)記位點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和兩個(gè)未偶自旋間的距離及其變化。其距離測(cè)量方法的特點(diǎn)是測(cè)距范圍寬，受其它因素影響小，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象變化分析更加有效。SDSL-EPR可研究溶液中類似生理環(huán)境下的蛋白質(zhì)，更加適合用于測(cè)量結(jié)構(gòu)變化的動(dòng)態(tài)過(guò)程，解決了許多生物學(xué)研究中的難點(diǎn)問(wèn)題，例如難以獲得結(jié)晶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、膜蛋白和大分子蛋白復(fù)合體的構(gòu)象分析、溶液狀態(tài)下蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化、蛋白質(zhì)之間和蛋白質(zhì)與膜之間的相互作用等。
　　SDSL-EPR距

3、離測(cè)量方法目前仍然存在一些問(wèn)題:由于生物樣品的多樣性，實(shí)際測(cè)量中許多因素都可能引起連續(xù)波電子順磁共振(Continues Wave ElectronParamagnetic Resonance，CW-EPR)波譜增寬，包括待標(biāo)記位點(diǎn)的不完全標(biāo)記、生物分子的整體運(yùn)動(dòng)和自旋標(biāo)記側(cè)鏈的局部運(yùn)動(dòng)、自旋弛豫效應(yīng)、測(cè)量溫度以及波譜測(cè)量參數(shù)選擇等，這些因素都會(huì)引入距離測(cè)量誤差。然而，目前所有的CW-EPR距離計(jì)算方法均難以完全避免上述因素對(duì)距離測(cè)量準(zhǔn)

4、確度的影響。因此，如何有效地從EPR波譜中分辨并提取出未偶自旋相互作用導(dǎo)致的波譜增寬，就成為CW-EPR距離測(cè)量方法需解決的核心問(wèn)題。
　　本工作的目的是針對(duì)目前SDSL-EPR距離測(cè)量方法在生物分子結(jié)構(gòu)與功能研究中的現(xiàn)狀，建立EPR測(cè)量生物大分子內(nèi)位點(diǎn)之間距離的實(shí)驗(yàn)方法和新的距離校準(zhǔn)與刻度方法，提高CW-EPR測(cè)量距離的準(zhǔn)確度和精度，為在溶液或生理環(huán)境下研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系建立新的技術(shù)方法。
　　方法:(1)在傅立

5、葉去卷積距離計(jì)算(Fourier Deconvolution DistanceMeasurement，F(xiàn)DDM)方法基礎(chǔ)上，編寫波譜擬合-傅立葉去卷積計(jì)算方法(Spectrum Simulation-Fourier Deconvolution Distance Measurement,SS-FDDM)與增寬函數(shù)高斯擬合相結(jié)合的新的距離計(jì)算軟件;通過(guò)優(yōu)化波譜擬合過(guò)程，增加波譜和增寬函數(shù)的高斯擬合程序和雙自旋波譜的反向擬合程序，改善波譜擬合

6、效果;通過(guò)在距離計(jì)算環(huán)節(jié)中增加對(duì)單/雙自旋波譜以及增寬函數(shù)的校正程序，提高距離計(jì)算的精度;運(yùn)用新的距離計(jì)算軟件計(jì)算距離已知的雙自旋化合物的距離，檢驗(yàn)軟件的實(shí)際應(yīng)用效果并對(duì)軟件加以改進(jìn)。(2)在CW-EPR測(cè)距范圍內(nèi)建立不同條件下（不同溶劑、濃度、溫度、功率等）測(cè)量微量溶液樣品中未偶自旋相互作用導(dǎo)致的波譜增寬效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法;合成具有剛性骨架結(jié)構(gòu)、分子尺寸確定、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的系列單/雙自旋化合物作為距離刻度標(biāo)尺，在不同條件下建立客觀的距離校準(zhǔn)和

7、刻度方法。(3)運(yùn)用蛋白質(zhì)分子構(gòu)建距離測(cè)量的生物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?選用肝臟免疫調(diào)控蛋白肝臟及淋巴結(jié)竇內(nèi)皮細(xì)胞C型凝集素(the human liver andlymph node sinusoidal endothelial cell C-type lectin，hLSECtin)的糖基識(shí)別結(jié)構(gòu)域(carbohydrate-recognition domains，CRD)為模板，在其鈣離子結(jié)合區(qū)域設(shè)計(jì)單/雙半胱氨酸(Cys)突變體，利用定點(diǎn)自旋

8、標(biāo)記技術(shù)將單/雙未偶自旋引入模型樣品，通過(guò)pET28b-Tat原核表達(dá)載體表達(dá)模型樣品，為后期測(cè)量未偶自旋間距離的變化特性并對(duì)所建立方法進(jìn)行應(yīng)用和驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。
　　結(jié)果:(1)綜合應(yīng)用EPR波譜擬合、增寬函數(shù)的高斯擬合和雙自旋波譜反向擬合等方法，改進(jìn)了原有的距離計(jì)算方法(S S-FDDM);通過(guò)比較不同條件下C60雙自旋分子的距離計(jì)算結(jié)果，證明新的計(jì)算方法對(duì)波譜的處理更靈活，擴(kuò)大了波譜擬合軟件的適用范圍，特別是對(duì)低溫粉末譜的有效

9、擬合，能有效消除實(shí)驗(yàn)譜的高頻噪音，并可去除人工確定增寬函數(shù)截止點(diǎn)的過(guò)程，在一定程度上克服人為因素的影響，對(duì)距離計(jì)算的準(zhǔn)確性和客觀性均有提高;新的波譜擬合-距離計(jì)算軟件基本可以適用于大部分未偶自旋相互作用的EPR波譜解析和去卷積計(jì)算。(2)構(gòu)建了三種雙自旋間距不同的以C60為骨架的雙自旋化合物作為距離刻度標(biāo)尺。實(shí)驗(yàn)表明C60雙自旋分子尺寸確定、分子穩(wěn)定、骨架結(jié)構(gòu)剛性好，滿足距離刻度標(biāo)尺的要求，且在結(jié)構(gòu)上優(yōu)于同類實(shí)驗(yàn)采用雙螺旋核酸結(jié)構(gòu)或“炔

10、-苯”骨架結(jié)構(gòu)的標(biāo)尺。結(jié)合不同條件下的距離測(cè)量結(jié)果，優(yōu)化了微量溶液樣品中未偶自旋相互作用導(dǎo)致的波譜增寬效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件，建立了不同條件下（不同溶劑、濃度、溫度、功率）的距離刻度方法和校正標(biāo)準(zhǔn);目前的距離刻度范圍為8～14(A)，綜合各種條件獲得的距離測(cè)量精度約為0.84(A)。(3)成功構(gòu)建了單/雙Cys點(diǎn)突變hLSECtin-CRD結(jié)構(gòu)域蛋白模型，通過(guò)pET28b-Tat載體實(shí)現(xiàn)了六組單/雙Cys點(diǎn)突變蛋白模型的高效可溶性表達(dá)，并獲得了

11、初步純化的樣品，為進(jìn)一步開展hLSECtin-CRD的構(gòu)象變化分析提供了條件。
　　結(jié)論:本工作提出了用雙自旋化合物分子對(duì)EPR測(cè)量距離進(jìn)行校正與刻度并建立相應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法的設(shè)想。改進(jìn)并編制了新的CW-EPR距離計(jì)算軟件;在8-14A范圍建立了穩(wěn)定的雙自旋距離刻度分子標(biāo)尺及其距離刻度與校正的實(shí)驗(yàn)方法;完成了單/雙Cys點(diǎn)突變體距離測(cè)量蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建。課題研究結(jié)果已基本達(dá)到了建立EPR測(cè)量生物大分子內(nèi)位點(diǎn)之間距離方法的目的。