牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠種植體骨結(jié)合的研究.pdf

1、目的:
　　探討系統(tǒng)應(yīng)用牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠種植體骨結(jié)合的影響，為促進(jìn)種植體的骨結(jié)合提供一條嶄新的思路。
　　方法:
　　1、酶解法培養(yǎng)GFP+C57/BL轉(zhuǎn)基因小鼠牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(gingiva-derivedmesenchymal stem cells，GMSCs)，流式檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物，同時(shí)進(jìn)行成骨誘導(dǎo)及上皮樣細(xì)胞誘導(dǎo)。
　　2、去勢(shì)法建立骨質(zhì)疏松模型:3月齡純種wistar雌性正常大鼠為對(duì)照

2、組，摘除雙側(cè)卵巢的3月齡純種wistar雌性大鼠為實(shí)驗(yàn)組。術(shù)后3個(gè)月處死各組大鼠，通過(guò)測(cè)定血清堿性磷酸酶及組織HE染色鑒定模型是否成功建立。
　　3、取63只3月齡純種wistar雌性大鼠隨機(jī)分為3組:A組（正常+PBS）(n=21):種植術(shù)前30分鐘尾靜脈注入PBS;B組（去勢(shì)+PBS）(n=21):去勢(shì)術(shù)后3個(gè)月，種植術(shù)前30分鐘尾靜脈注入PBS;C組（去勢(shì)+GMSCs）(n=21):去勢(shì)術(shù)后3個(gè)月，種植術(shù)前30分鐘尾靜脈注入

3、GMSCs懸液。
　　4、各組大鼠均全麻下于雙側(cè)股骨遠(yuǎn)心端植入種植體，種植術(shù)后1周、4周、8周各組分別處死6只大鼠，采用熒光定量PCR(relative fluorescence quantitativepolymerase chain-reaction，RT-PCR)檢測(cè)種植體周圍骨組織成骨相關(guān)基因及炎癥因子的表達(dá);采用硬組織切片亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色檢測(cè)種植骨結(jié)合率;于4周各組另處死3只大鼠通過(guò)免疫組化及DAPI染色檢測(cè)GFP

4、+GMSCs歸巢。
　　結(jié)果:
　　1、成功培養(yǎng)C57/BL小鼠GMSCs，為長(zhǎng)梭形，典型成纖維細(xì)胞形態(tài)，GFP表達(dá)陽(yáng)性且穩(wěn)定。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果: GMSCs表達(dá)CD29(99.9％)、CD44(92.6％)，不表達(dá)CD34(5.1％)、CD31(4％)、CD45(0.8％)、CD11b(1.5％)。成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)28天后鏡下可見(jiàn)鈣化結(jié)節(jié)，茜素紅染色后結(jié)節(jié)呈紅褐色;上皮樣細(xì)胞誘導(dǎo)液誘導(dǎo)14天后可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)明顯改變，似鋪路石

5、樣。
　　2、成功建立wistar大鼠骨質(zhì)疏松模型，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中堿性磷酸酶活性明顯高于對(duì)照組，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。HE染色表明:實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比股骨骨小梁數(shù)目減少，部分骨小梁變細(xì)斷裂，不連續(xù)，骨髓腔變大。
　　3、檢測(cè)種植體周圍組織成骨相關(guān)基因及炎性因子表達(dá)
　　術(shù)后1周:A組、C組與B組相比，BSP表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); OPN表達(dá)上調(diào)， A、B兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

6、（P＜0.05），B、C兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;IL-1表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　術(shù)后4周:A組、C組與B組相比，BSP、OPN表達(dá)上調(diào)，IL-1表達(dá)下調(diào)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　術(shù)后8周:A組、C組與B組相比，BSP表達(dá)略上調(diào)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05); OPN表達(dá)上調(diào)，IL-1表達(dá)下調(diào)，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。4、1周、4周、8周硬組織切片

7、結(jié)果顯示A組、C組種植體骨結(jié)合率高于B組，1周時(shí)B組和C組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其余均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。5、4周組織石蠟切片免疫組化及DAPI染色后，種植體周圍組織可見(jiàn)GFP+細(xì)胞歸巢。
　　結(jié)論:
　　1、酶解法分離培養(yǎng)GFP+牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞操作簡(jiǎn)便，傳代2-3次后細(xì)胞純度較高，GFP表達(dá)穩(wěn)定。牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞有成骨向分化及成上皮樣細(xì)胞分化的潛能。
　　2、通過(guò)去勢(shì)法可成功建立骨質(zhì)疏松模型