雄芍湯防治肝纖維化作用及機(jī)理研究.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)主要是一種組織病理學(xué)概念。HF指肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)成分過(guò)度增生與異常沉積，導(dǎo)致肝結(jié)構(gòu)或(和)功能異常的病理變化。多數(shù)慢性肝炎均可發(fā)生肝纖維化，部分肝纖維化進(jìn)一步發(fā)展可形成肝硬化和肝癌，嚴(yán)重影響人類健康和生命。而目前臨床上尚無(wú)理想的抗HF藥物，因此能否延緩、終止HF的進(jìn)展，甚或逆轉(zhuǎn)HF至正常，具有重大意義。
　　 HF的形成涉及諸多因素和環(huán)節(jié)，單純應(yīng)用針對(duì)某一環(huán)節(jié)作用的藥物可能難以

2、逆轉(zhuǎn)纖維化進(jìn)程，研究表明，中藥復(fù)方有多途徑，多靶點(diǎn)抗HF的綜合藥理作用，著眼于肝纖維化發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)，發(fā)掘出療效較好的抗肝纖維化中藥復(fù)方是中醫(yī)藥工作者的重要使命。
　　 雄芍湯乃導(dǎo)師門九章教授治療肝纖維化的有效驗(yàn)方，本論文中我們一方面進(jìn)行了雄芍湯抗大鼠免疫性肝纖維化的作用和機(jī)理實(shí)驗(yàn)研究，另一方面進(jìn)行了雄芍湯含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)的人肝星狀細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究，簡(jiǎn)述如下：
　　 目的：從癥狀體征、肝功、肝纖四項(xiàng)、病理形態(tài)學(xué)等

3、方面綜合評(píng)價(jià)雄芍湯防治免疫性肝纖維化的療效，并從肝纖維化發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用的環(huán)節(jié)入手明確雄芍湯抗肝纖維化的機(jī)理。
　　 方法：
　　 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用豬血清腹腔注射法制造大鼠肝纖維化模型。設(shè)立正常對(duì)照組、模型組對(duì)照組、扶正化瘀膠囊對(duì)照組、雄芍湯預(yù)防組和雄芍湯高、低劑量組(以下分別簡(jiǎn)稱正常組、模型組、扶正組、雄預(yù)組、雄高組、雄低組)。觀察大鼠毛色澤、體重等一般情況；肉眼觀察大鼠新鮮肝臟的外觀；計(jì)算肝重與體重的比值，脾重與

4、體重的比值；常規(guī)方法檢測(cè)大鼠血清肝功能指標(biāo)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、白蛋白與球蛋白比值(A/G)；同位素放射免疫分析法檢測(cè)肝纖維化血清標(biāo)志物：透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原氨端肽(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)的含量；黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)血清SOD活力，TBA法測(cè)定血清MDA含量；ELISA法檢測(cè)大鼠血清MMP-9、IgE、C3的含量；消化法檢測(cè)肝組織羥

5、脯氨酸含量；HE染色和Masson染色法觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)改變；免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)大鼠肝組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-SMA、TGF-β1表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)肝組織中TIMP-1mRNA的表達(dá)。
　　 2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用MTT比色法測(cè)定大鼠雄芍湯藥物血清對(duì)體外培養(yǎng)的人肝星狀細(xì)胞LX-2增殖的影響；免疫組織化學(xué)染色法測(cè)LX-2中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-SMA、TGF-β1的表達(dá)。
　

6、　 結(jié)果：
　　 1.給大鼠腹腔注射豬血清15周后，肝纖維化模型復(fù)制成功。
　　 2.雄芍湯可以改善免疫性肝纖維化大鼠毛色、進(jìn)食量和體重等一般情況。
　　 3.肝功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果：模型組血清AST、ALT、GLB均顯著高于正常組(P<0.01)，ALB、A/G均顯著低于正常組(P<0.01)；除了雄低組AST與模型組差別不顯著外，雄芍湯各治療組血清AST、ALT、GLB均顯著低于模型組(P<0.05或P<0.0

7、1)，ALB、A/G均顯著高于模型組(P<0.01)，雄預(yù)組血清GLB顯著低于扶正組(P<0.05)，雄預(yù)組和雄高組A/G顯著高于扶正組(P<0.05)。
　　 4.血清肝纖維化標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果：模型組血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ均顯著高于正常組(P<0.01)，各治療組血清HA、PCⅢ、LN均顯著低于模型組(P<0.05或P<0.01)，其中雄高組血清HA和LN顯著低于雄預(yù)組，且雄高組血清LN顯著低于扶正化瘀(P<0.05)，雄

8、預(yù)組血清CⅣ顯著低于模型組(P<0.05)，而其他治療組血清CⅣ與模型組差別不明顯。
　　 5.肝重指數(shù)、脾重指數(shù)結(jié)果：所有實(shí)驗(yàn)組肝重指數(shù)均無(wú)顯著差別；模型組脾重指數(shù)明顯大于正常組(P<0.01)，雄預(yù)組和雄低組脾重指數(shù)均明顯小于模型組(P<0.01)，雄高組和扶正組脾重指數(shù)均與模型組差別不明顯。
　　 6.肝組織病理觀察結(jié)果：模型組大鼠肝組織炎癥活動(dòng)度、纖維化半定量計(jì)分均顯著高于正常組(P<0.01)；除雄低組外，各治

9、療組均顯著低于模型組(P<0.05或P<0.01)，顯著高于正常組(P<0.05或P<0.01)。
　　 7.肝組織Hyp檢測(cè)結(jié)果：模型組肝組織Hyp含量顯著高于正常組(P<0.01)，各治療組均顯著低于模型組(P<0.05或P<0.01)，雄預(yù)組和雄高組均低于扶正組(P<0.05)。
　　 8.大鼠血清SOD和MDA含量檢測(cè)結(jié)果：模型組大鼠血清SOD含量顯著低于正常組(P<0.01)，MDA含量顯著高于正常組(P<0.

10、01)，除扶正組SOD含量與模型組差別不顯著外，各治療組SOD含量均顯著高于模型組(P<0.05或P<0.01)，MDA含量均顯著低于模型組(P<0.01)，其中雄預(yù)組SOD含量顯著高于雄低組(P<0.05)，雄低組顯著高于雄高組，各治療組間MDA含量差別不顯著。
　　 9.大鼠血清IgE、C3的含量檢測(cè)結(jié)果：模型組大鼠血清IgE、補(bǔ)體C3均與正常組差別不顯著，雄預(yù)組IgE顯著高于其他所有組(P<0.05或P<0.01)，雄預(yù)組

11、補(bǔ)體C3顯著低于正常組和模型組。
　　 10.大鼠肝組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-SMA、TGF-β1表達(dá)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：模型組大鼠肝組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-SMA、TGF-β1含量顯著高于正常組(P<0.01)，各治療組均顯著低于模型組(P<0.01)，各治療組中雄預(yù)組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和α-SMA含量顯著低于扶正組(P<0.05或P<0.01)，雄高組Ⅲ型膠原含量也顯著低于扶正組(P<0.01)，雄高組和雄預(yù)組Ⅲ型膠

12、原、α-SMA含量均顯著低于雄低組(P<0.01)雄低組TGF-β1表達(dá)顯著低于雄高組(P<0.01)。
　　 11.大鼠血清MMP-9含量和肝組織TIMP-1mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果：模型組大鼠血清MMP-9含量顯著低于正常組(P<0.05)，肝組織TIMP-1mRNA表達(dá)顯著高于正常組(P<0.01)；雄預(yù)組血清MMP-9含量顯著高于模型組(P<0.01)，其他用藥組與模型組差別不顯著；雄高組肝組織TIMP-1mRNA表達(dá)顯著低

13、于模型組(P<0.01)，與正常組差別不顯著。
　　 12.雄芍湯含藥血清對(duì)LX-2增殖的抑制率結(jié)果：20％和10％空白血清組抑制率均低于相應(yīng)濃度的扶正組和雄芍湯組(P<0.01)，5％空白血清組抑制率與相應(yīng)濃度的扶正組和雄芍湯組差別不顯著；雄芍湯各濃度含藥血清組對(duì)LX-2增殖的抑制率顯著高于相應(yīng)濃度的扶正含藥血清組(P<0.05或P<0.01)。雄芍湯各濃度含藥血清組中，20％組和10％組對(duì)LX-2增殖的抑制率差別不顯著，但均

14、顯著高于雄芍湯5％組(P<0.01)。
　　 13.含藥血清對(duì)LX-2中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-SMA、TGF-β1的表達(dá)影響的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：雄芍血清組和扶正血清組LX-2中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-SMA和TGF-β1含量顯著低于空白血清組(P<0.01)，雄芍血清組和扶正血清組Ⅰ型膠原差別不顯著，扶正血清組Ⅲ型膠原、α-SMA含量顯著低于雄芍血清組(P<0.05)，雄芍血清組TGF-β1含量顯著低于扶正血清組(P<0.

15、01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.雄芍湯有確切的抗免疫性肝纖維化療效，早期預(yù)防用藥綜合療效較好，其抗肝纖維化的機(jī)理與扶正化瘀膠囊不完全相同，且在一定條件下某些方面的抗肝纖維化療效優(yōu)于扶正化瘀膠囊。
　　 2.雄芍湯抗肝纖維化的作用機(jī)理主要有如下幾方面
　　 2.1 保護(hù)肝細(xì)胞，改善肝功能的作用。
　　 2.2 既抑制膠原等ECM的合成，又促進(jìn)其降解。
　　 2.3 提高肝纖維化大鼠清除氧自