雄芍湯干預(yù)DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的代謝組學(xué)研究.pdf

1、第一部分雄芍湯有效成份的含量測(cè)定
　　目的：通過(guò)對(duì)雄芍湯中粗多糖、總苷、總生物堿三個(gè)主要有效成份的含量進(jìn)行測(cè)定，保證雄芍湯藥物質(zhì)量可靠。
　　方法：雄芍湯采用常規(guī)水煎煮法作為提取方法。粗多糖分離采用醇沉法，除蛋白雜質(zhì)采用Sevage法；總苷分離采用水飽和正丁醇萃取法；總生物堿分離采用氨水乙醚冷浸法。雄芍湯粗多糖提取物中總多糖的含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法，總苷提取物中人參總皂苷的含量測(cè)定采用香草醛-冰醋酸-高氯酸紫外顯色法，雄芍

2、湯總生物堿提取物中總堿的含量測(cè)定采用酸性染料比色法。
　　結(jié)果：粗多糖提取物中總多糖平均含量為541.62 mg/g；總苷提取物中人參總皂苷的含量為642.78mg/g；總生物堿提取物中總堿的平均含量為828.79mg/g。
　　結(jié)論：雄芍湯中粗多糖、總苷、總生物堿三個(gè)主要有效成份的提取方法有效，含量測(cè)定符合藥效學(xué)研究，雄芍湯質(zhì)量穩(wěn)定，為下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)打好藥效學(xué)基礎(chǔ)。
　　第二部分以NMR為基礎(chǔ)的DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化

3、模型代謝組學(xué)研究
　　目的：通過(guò)二甲基亞硝胺（DMN）誘導(dǎo)建立大鼠肝纖維化模型，基于核磁共振技術(shù)（NMR）技術(shù)尋找大鼠尿液及血清中潛在的代謝物分子，對(duì)模型大鼠肝臟組織進(jìn)行代謝組學(xué)研究,為肝纖維化診斷提供一種新的無(wú)創(chuàng)性診斷方法。
　　方法：將52只SD雄性大鼠，采用隨機(jī)法分為正常對(duì)照組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為正常組）12只及肝纖維化模型組40只。給模型組大鼠腹腔注射DMN制備肝纖維化模型，按1ml/kg劑量注射1％DMN，隔日1次，每周3

4、次，連續(xù)4周，正常組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。造模期間，模型組大鼠意外死亡7只。造模成功后，隨機(jī)抽取模型組大鼠6只、正常組大鼠6只取材。采用代謝籠收集正常組、模型組的24小時(shí)尿液后處死取材。觀察大鼠一般情況和新鮮肝臟；送檢血清肝功能指標(biāo)三項(xiàng)和血清肝纖維化標(biāo)志物四項(xiàng)；HE染色觀察肝組織病理學(xué)改變；基于NMR分析技術(shù)對(duì)模型大鼠和正常大鼠尿液及血液樣本進(jìn)行測(cè)定分析，采用SIMCA-P軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，找尋DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化代謝損傷標(biāo)志

5、物。
　　結(jié)果：對(duì)正常組和模型組的尿液圖譜進(jìn)行PCA分析顯示，模型組與正常組可明顯區(qū)分，正常組樣本大多位于PC1的負(fù)半軸，而模型組大多位于PC1的正半軸，說(shuō)明通過(guò)肝纖維化造模后，模型組動(dòng)物的尿液組成發(fā)生了較大變化。模型組大鼠尿液中苯乙酰甘氨酸、馬尿酸、胍基乙酸含量降低，而?；撬?、丁酸鹽、琥珀酸鹽、N-乙酰天冬氨酸、2-羥基丁酸鹽含量升高。對(duì)正常組和模型組大鼠血清的CPMG譜進(jìn)行了主成分分析，正常與模型大鼠可明顯區(qū)分，與正常組相比，

6、模型組中羥基丁酸、乳酸、醋酸、谷氨酸含量升高；β-葡萄糖、α-葡萄糖含量降低。對(duì)正常和模型大鼠led譜的主成分分析結(jié)果顯示，肝纖維化模型大鼠的大分子物質(zhì)也發(fā)生了改變。與正常組相比，模型組大鼠血清中HDL-CH3、N-乙酰葡萄糖胺、丙酮、-N(CH3)3、Lipid-CH=CH-升高；Lipid-CH2CH2CO、Lipid-CH2CH=、Lipid-CH2CO-、Lipid=CHCH2CH=、磷脂酰膽堿降低。
　　結(jié)論：我們?cè)趧?dòng)物

7、模型中尋找到這些代謝標(biāo)志物，它們的變化趨勢(shì)反應(yīng)了肝纖維化模型多種代謝功能失調(diào)，如氨基酸、脂肪酸和葡萄糖等代謝紊亂，有很大潛能來(lái)作為肝纖維化的早期無(wú)創(chuàng)診斷線索。
　　第三部分雄芍湯對(duì)DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型尿液及血清代謝損傷標(biāo)志物的干預(yù)
　　目的：應(yīng)用代謝組學(xué)平臺(tái)分析雄芍湯干預(yù)肝纖維化模型大鼠代謝損傷標(biāo)志物的變化趨勢(shì)。進(jìn)一步闡明雄芍湯具有良好的抗大鼠肝纖維化作用。
　　方法：造模成功的第2天開(kāi)始，模型組剩余27只大鼠平

8、均分為3組，模型組9只，雄芍湯組9只，扶正化瘀組9只。給扶正組9只；雄芍組9只分別灌胃相應(yīng)的雄芍湯水煎劑和扶正化瘀膠囊，給藥劑量分別以成人臨床劑量，推算出人每公斤體重用量，根據(jù)體型系數(shù)換算成大鼠用量。每日灌胃一次，連續(xù)4周。同時(shí)正常組及模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，每日一次，連續(xù)4周。給藥結(jié)束后，采用代謝籠收集雄芍組、扶正組、模型組、正常組的24小時(shí)尿液后處死取血、取肝?；贜MR分析技術(shù)對(duì)雄芍組大鼠、扶正組大鼠、模型組大鼠和正常組大

9、鼠的尿液及血液樣本進(jìn)行分析測(cè)定，同時(shí)采用SIMCA-P軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，探尋各組大鼠代謝損傷標(biāo)志物的變化趨勢(shì)。
　　結(jié)果：PCA分析顯示，正常組位于 PC1的負(fù)半軸，而模型組大多位于PC1的正半軸，扶正組和雄芍組位于正常和模型組的中間，說(shuō)明藥物干預(yù)后體現(xiàn)出明顯的治療作用，但尚未回歸到正常狀態(tài)；此外，扶正組和雄芍組無(wú)明顯區(qū)分，說(shuō)明從尿液代謝物的角度來(lái)看，兩組的治療效果接近。尿液代謝譜苯乙酰甘氨酸、胍基乙酸在模型組含量降低，給藥后扶正

10、組和雄芍組均可使其含量升高，呈現(xiàn)回歸趨勢(shì)；琥珀酸鹽、丁酸鹽、2-羥基丁酸鹽在模型組中含量升高,給予扶正化瘀膠囊和雄芍湯后含量均降低，其中雄芍組可使三者均回歸至接近正常水平，而扶正只能使2-羥基丁酸鹽回歸至正常水平，說(shuō)明二者的治療效果和作用機(jī)制有所不同。對(duì)正常組、模型組、扶正組、雄芍組的血液小分子物質(zhì)核磁譜進(jìn)行了PCA分析顯示，可見(jiàn)正常組位于PC1的負(fù)半軸，而模型組大多位于PC1的正半軸，扶正組和雄芍組位于正常和模型組的中間，說(shuō)明藥物干預(yù)

11、后體現(xiàn)出明顯的治療作用，但尚未回歸到正常狀態(tài)；此外，雄芍組更接近正常組，說(shuō)明從血清代謝物的角度來(lái)看，雄芍組的治療效果略好。α-Glucose和β-Glucose在模型組含量降低，給藥后扶正組和雄芍組均可使其含量升高，即呈現(xiàn)回歸趨勢(shì)，雄芍組回歸趨勢(shì)優(yōu)于扶正組；谷氨酸在肝纖維化模型組中含量升高，給予扶正化瘀膠囊和雄芍湯后其含量均降低，說(shuō)明雄芍組和扶正組使其呈現(xiàn)回歸趨勢(shì)，且雄芍回歸趨勢(shì)效果優(yōu)于扶正組。對(duì)正常、模型、扶正、雄芍組血液大分子物質(zhì)的