肝纖維化、肝癌的N-糖組學(xué)動(dòng)態(tài)研究.pdf

1、原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第五位最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在全世界腫瘤患者的致死率中高居第三位。在我國(guó)，由于乙肝病毒(HBV)的高感染率而導(dǎo)致慢性肝病、肝硬化、肝癌的高發(fā)性。肝炎-肝纖維化/硬化-肝癌是慢性肝病的代表性不良發(fā)展過(guò)程，早期肝纖維化具有可逆轉(zhuǎn)性，早期診斷和治療可阻斷其向肝硬化方向發(fā)展；同樣，早期HCC若得到及時(shí)手術(shù)治療，可顯著提高五年生存率。目前用于HCC高危人群篩查的指標(biāo)主要是

2、血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)檢測(cè)及超聲檢查。但兩者在HCC早期診斷中均存在靈敏度不高的缺陷。篩選用于HCC早期診斷和隨訪的敏感性標(biāo)志物仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)，尋求新的靈敏度和特異性更高的非創(chuàng)性血清標(biāo)志物，對(duì)于提高HCC診斷效率，療效監(jiān)控以及預(yù)后評(píng)估均具有至關(guān)重要的意義。
　　 異常糖基化與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)。大多數(shù)N-糖蛋白由肝臟或B淋巴細(xì)胞合成，血清中N-糖組分的改變可以反映肝臟和B淋巴細(xì)胞的生理功

3、能變化。因此，異常糖基化的數(shù)量及質(zhì)量上的變化有望成為慢性肝病早期非創(chuàng)性診斷的依據(jù)?；贒NA測(cè)序儀的熒光糖電泳(DSA-FACE)、基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF)、高效液相色譜(HPLC)以及凝集素微陣列(lectin microarray)等技術(shù)的發(fā)展為我們提供了快速，高靈敏度和高通量的N-糖組圖譜檢測(cè)手段，使血清N-糖鏈檢測(cè)運(yùn)用于臨床診斷和隨訪成為可能。本研究從大樣本臨床病例和二乙基亞硝胺(diethylini

4、trosamine，DENA)誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型兩個(gè)方面探討了N-糖組分析在HCC早期診斷中的價(jià)值。
　　 第一部分：乙肝相關(guān)肝纖維化和肝癌大樣本臨床病例N-糖組學(xué)研究
　　 本研究從N-糖組分析入手，評(píng)估N-糖鏈以及N-糖鏈相關(guān)的多指標(biāo)聯(lián)合診斷模型在肝纖維化和HCC鑒別診斷及隨訪中的價(jià)值。我們采用DSA-FACE的方法，檢測(cè)了393例研究對(duì)象(128例乙肝相關(guān)的肝纖維化，145例HCC和120例正常對(duì)照)以及HCC切除

5、手術(shù)前后10對(duì)隨訪病例的血清N-糖組圖譜，比較肝纖維化、HCC狀態(tài)下其特征性改變，并分析各峰值的差異。應(yīng)用logistics回歸法建立了基于N-糖標(biāo)志物的多參數(shù)聯(lián)合診斷模型，并用ROC曲線評(píng)估各指標(biāo)的診斷效力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)N-糖鏈結(jié)構(gòu)(NG1A2F,Peak4和NA3Fb，Peak9)可作為HCC的特異性診斷標(biāo)志物。Log(p9/p4)在鑒別肝纖維化和肝癌時(shí)，可以達(dá)到與AFP近似的診斷效力。N-糖標(biāo)志物與AFP的聯(lián)合診斷模型Cscor

6、e B在鑒別診斷肝纖維化和HCC時(shí)，診斷效力較單獨(dú)使用AFP提高了7-10％。N-糖標(biāo)志物log(p9/p4)在鑒別早期和晚期HCC時(shí)，與單獨(dú)使用AFP相比，其檢測(cè)特異性提高了16％，準(zhǔn)確度提高了8％。N-糖標(biāo)志物對(duì)于HCC的診斷效力在手術(shù)前后的HCC隨訪病例中得到了驗(yàn)證。結(jié)論：N-糖鏈log(p9/p4)有望成為新的HCC診斷標(biāo)志物；N-糖標(biāo)志物與AFP聯(lián)合診斷模型可顯著提高HCC的診斷效力，并可用于HCC進(jìn)展的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和療效評(píng)價(jià)。<

7、br>　　 第二部分：DENA誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型N-糖組學(xué)動(dòng)態(tài)研究
　　 本研究采用DENA腹腔注射的方法建立大鼠肝癌模型，并利用此模型研究N-糖組圖譜在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化。用DSA-FACE的方法檢測(cè)了DENA誘導(dǎo)后肝臟病變不同發(fā)展階段的大鼠血清，及血清免疫球蛋白的N-糖組圖譜，并首次將DSA-FACE技術(shù)應(yīng)用于肝臟組織蛋白的N-糖組檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)巖藻糖基化修飾的兩天線N-糖鏈(R5a和R5b)在肝纖維化-肝

8、硬化-HCC的發(fā)展過(guò)程中逐漸升高，而另一個(gè)無(wú)巖藻糖修飾的兩天線N-糖鏈(P5)則顯著下降。與正常對(duì)照相比，log(R5a/P1)和log(R5b/P1)在HCC組中顯著升高，在肝纖維化和肝硬化組中則無(wú)顯著性差異，可以作為肝癌的特異性標(biāo)志物。經(jīng)抗腫瘤藥物farnesylthiosalicyclic acid(FTS)治療后，血清N-糖鏈標(biāo)志物[P5，R5a，R5b，log(R5a/P1)，log(R5b/P1]水平均恢復(fù)到DENA處理前的

9、狀態(tài)，提示血清N-糖鏈標(biāo)志物可有效監(jiān)測(cè)抗腫瘤藥物FTS的治療效果。大鼠肝臟組織蛋白N-糖組分析發(fā)現(xiàn)R5b隨著肝臟疾病狀態(tài)的加重而升高，提示N-糖鏈R5b來(lái)源于肝臟細(xì)胞，進(jìn)一步證實(shí)血清中其豐度的改變可直接反映肝臟細(xì)胞的病變。除DSA-FACE進(jìn)行N-糖鏈分析外，本研究采用糖蛋白染色、凝集素印跡以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法，探討了肝臟病變中血清N-糖組變化的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)α-1，6-核心巖藻糖基化蛋白水平在HCC大鼠的血清及肝臟組織中均有顯

10、著提高，證實(shí)了異常巖藻糖基化作用的增強(qiáng)與HCC的發(fā)生相關(guān)。結(jié)合糖基化修飾過(guò)程的關(guān)鍵代謝酶，如N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的mRNA定量分析，初步闡明了肝臟病變過(guò)程中異常糖基化的分子機(jī)制。結(jié)論：在DENA-誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型中，N-糖標(biāo)志物可用來(lái)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)HCC的進(jìn)展過(guò)程，并可用來(lái)評(píng)估抗腫瘤藥物的治療效果；異常核心巖藻糖基化與肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有著密切關(guān)系。
　　 綜上所述，通過(guò)本課題的研究，我們發(fā)現(xiàn)異常巖藻糖基化與HCC的