Cryptococcus podzolicus及其相關(guān)分離菌株的綜合系統(tǒng)分類和重命名研究.pdf

1、目的：
　　1、比較和探討多位點(diǎn)測(cè)序分型技術(shù)（MLST）和基質(zhì)輔助激光解吸—飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF-MS）在銀耳科（Tremellaceae）的屬間、種間及種內(nèi)分類研究的穩(wěn)定性和可靠性。
　　2、對(duì)本研究所使用全部菌株進(jìn)行規(guī)范化命名的驗(yàn)證及更新。
　　3、確定課題組前期分離的4株與Cryptococcus podzolicus相鄰的菌株在分類學(xué)上的位置。
　　方法：
　　1、選取20株含Cry

2、ptococcus podzolicus在內(nèi)及鄰近菌屬的菌株，以模式菌株Cryptococcus neoformans CBS132T作為outgroup，以5個(gè)管家基因（ITS，D1/D2，rpb1，rpb2，tef1）的擴(kuò)增序列為研究對(duì)象，通過(guò)Bayesian法（MrBayes3.2.1）、最大似然法、鄰接法(MEGA6.0軟件)分別構(gòu)建MLST復(fù)合基因樹(shù)及D1/D2基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；應(yīng)用MALDI-TOF-MS采集蛋白指紋圖譜

3、，在BrukerDaltonics數(shù)據(jù)庫(kù)(BDAL)和CBS真菌保藏中心數(shù)據(jù)庫(kù)信息的基礎(chǔ)上，對(duì)20株菌進(jìn)行聚類分型，構(gòu)建聚類分型樹(shù)狀圖。
　　2、以上述研究為基礎(chǔ)，結(jié)合生理生化特征，綜合比較分析近期發(fā)表的關(guān)于Cryptococcus podzolicus及與之相鄰的其他菌屬的分類關(guān)系的研究結(jié)果。
　　3、對(duì)4株課題組分離的待測(cè)菌株進(jìn)行表型、生化及分子綜合系統(tǒng)分類鑒定。
　　結(jié)果：
　　1、三種方法所得到的樹(shù)狀圖在

4、種間的層面上，均出現(xiàn)了A、B、C三個(gè)分化枝，而在種內(nèi)的層面上，特別是A這一分化枝，均為Cryptococcus podzolicus，單一D1/D2區(qū)域所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上該菌種各菌株的進(jìn)化距離基本為零，而MLST及MALDI-TOF MS所得到的樹(shù)狀圖中，可以明顯觀察到菌株間親緣距離各不相同。
　　2、所研究的標(biāo)準(zhǔn)菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上的位置與近期文獻(xiàn)建議的最新分類系統(tǒng)吻合，依據(jù)文獻(xiàn)中提出的規(guī)范化命名方案，更名如下：Cryptoco

5、ccus podzolicus更名為Saitozyma podzolica，Cryptococcus flava更名為Saitozyma flava，Bullera ninhbinhensis更名為Saitozyma ninbinhensis，Cryptococcus paraflava更名為Saitozyma paraflava，Bullera miyagiana更名為Sugitazyma miyagiana，Bullera saka

6、eratica更名為Trimorphomyces sakaeratica。3、4株課題組前期分離的待測(cè)菌株鏡下細(xì)胞呈檸檬形，有出芽形成，在L-DOPA瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生巧克力樣的棕黑色色素，適宜生長(zhǎng)溫度是25-40℃，交配試驗(yàn)沒(méi)有觀察到子實(shí)體產(chǎn)生，抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)顯示對(duì)兩性霉素B及咪康唑敏感，對(duì)5-氟胞嘧啶中度敏感，對(duì)氟康唑及米卡芬凈耐藥，碳源、氮源利用試驗(yàn)及分子試驗(yàn)顯示其歸屬Saitozyma，但又有別于Saitozyma屬下已知的

7、菌種。
　　結(jié)論：
　　1、MLST及MALDI-TOF MS均可作為隱球菌屬中菌株分類鑒別中有效的輔助鑒別的分子生物學(xué)方法，相比于傳統(tǒng)的生理生化試驗(yàn)及間隔區(qū)和核糖體大亞基序列，能更可靠地揭示隱球菌屬中各菌種的種間及種內(nèi)的遺傳進(jìn)化關(guān)系；相比于MLST技術(shù)較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)周期及某些基因擴(kuò)增和測(cè)序的不確定性，MALDI-TOF-MS技術(shù)則更為快捷準(zhǔn)確。
　　2、本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了近期白逢彥、T.Boekhout等提出的Crypt